JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Fizyolojik Koşullar Altında Alfa-Sinüklein Yapısal Dinamiğinin İncelenmesi için Milisaniye Hidrojen / Döteryum Değişim Kütle Spektrometresi

Published: June 23, 2022
doi:
10.3791/64050
,
1Living Systems Institute, Department of Biosciences,University of Exeter

Summary

Monomerik alfa-sinükleinin yapısal topluluğu fizyolojik fonksiyonunu ve fizikokimyasal özelliklerini etkiler. Mevcut protokol, fizyolojik koşullar altında bu içsel olarak düzensiz proteinin monomeri hakkında konformasyonel bilgileri belirlemek için milisaniye hidrojen / döteryum değişim kütle spektrometrisinin ve müteakip veri analizlerinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.

Abstract

Alfa-sinüklein (aSyn), Parkinson hastalığının ayırt edici özellikleri olan Lewy cisimlerinde ve nöritlerinde fibriller agregaları bol miktarda bulunan, özünde düzensiz bir proteindir. Bununla birlikte, biyolojik aktivitesinin çoğu ve toplanması, proteinin çözünür monomer formunu merkezi olarak içerir. aSyn biyolojisinin ve patofizyolojisinin moleküler mekanizmalarının aydınlatılması, yapısal olarak yüksek oranda çözümlenmiş yöntemler gerektirir ve biyolojik koşullara duyarlıdır. Doğal olarak açılmış, meta-kararlı yapıları, monomerik aSyn’i birçok yapısal biyoloji tekniğine karşı dayanıklı hale getirir. Burada, böyle bir yaklaşımın uygulanması açıklanmaktadır: düşük termodinamik stabiliteye ve aSyn gibi zayıf koruma faktörlerine sahip proteinlerin incelenmesi için milisaniyelik zaman ölçeğinde hidrojen / döteryum değişim kütle spektrometresi (HDX-MS). Milisaniyelik zaman ölçeğinde, HDX-MS verileri, daha uzun etiketleme sürelerinde kaybolan ve sonuçta amino asit seviyesine kadar yapısal çözünürlük sağlayan aSyn’in çözücü erişilebilirliği ve hidrojene bağlı yapısı hakkında bilgi içerir. Bu nedenle, HDX-MS, konformasyonel dinamikler ve termodinamik, moleküller arası ve moleküller arası etkileşimler ve mutasyonların veya değişikliklerin çevresel koşullara yapısal etkisi hakkında yüksek yapısal ve zamansal çözünürlüklerde bilgi sağlayabilir. Geniş çapta uygulanabilir olsa da, monomerik aSyn’de milisaniye HDX-MS ölçümlerinin nasıl elde edileceği, analiz edileceği ve yorumlanacağı gösterilmiştir.

Introduction

Parkinson hastalığı (PH), dünya çapında milyonlarca insanı etkileyen nörodejeneratif bir hastalıktır1. Beynin substantia nigra pars compacta bölgesinde Lewy cisimleri ve Lewy nöritleri olarak bilinen sitoplazmik inklüzyonların oluşumu ile karakterizedir. Bu sitoplazmik inklüzyonların özünde düzensiz protein aSyn2’nin agregalarını içerdiği bulunmuştur. PD ve diğer sinükleinopatilerde, aSyn çözünür düzensiz bir durumdan çözünmez, yüksek oranda yapılandırılmış hastalıklı bir duruma dönüşür. Doğal formunda, monomerik aSyn, N- ve C-termini arasındaki uzun menzilli elektrostatik etkileşimler ve C-terminus ile amiloid olmayan beta bileşeni (NAC) bölgesi 3,4,5,6 arasındaki hidrofobik etkileşimler ile stabilize edilen çok çeşitli konformasyonları benimser. Mutasyonlar, çeviri sonrası modifikasyonlar ve yerel ortamdaki değişiklikler gibi bu stabilize edici etkileşimlerdeki herhangi bir bozulma, monomerin yanlış katlanmasına yol açabilir ve böylece toplama sürecini tetikleyebilir7.

aSyn 8,9,10,11’in oligomerik ve fibriller formları üzerinde çok sayıda araştırma mevcut olsa da, proteinin monomerik formunu incelemek ve hangi konformatörlerin işlevsel (ve nasıl) olduğunu ve hangilerininagregaya eğilimli olduğunu daha iyi anlamak için çok önemli bir ihtiyaç vardır. . İçsel olarak düzensiz, sadece 14 kDa büyüklüğünde ve kristalleşmesi zor olan aSyn monomeri, çoğu yapısal biyolojik tekniğe uygun değildir. Bununla birlikte, monomerik aSyn’in konformasyonel dinamiklerini ölçebilen bir teknik, son zamanlarda aksi takdirde elde edilmesi zor veya imkansız olacak önemli yapısal gözlemler üreten milisaniye HDX-MS’dir12,13,14. Milisaniye HDX-MS, amid hidrojenlerindeki izotopik değişimi izleyerek, milisaniye zaman ölçeğinde belirli bir protein bölgesinin çözücü erişilebilirliğini ve hidrojen bağlama ağı katılımını göstererek, protein konformasyonel topluluğunun ortalamasını hassas bir şekilde ölçer. HDX-MS’in milisaniyelik yönünü vurgulamak gerekir, çünkü doğal olarak açılmış, meta-kararlı doğası nedeniyle, aSyn, geleneksel HDX-MS sistemlerinin alt sınırının çok altında tezahür eden çok hızlı hidrojen değişim kinetiği sergiler. Örneğin, aSyn molekülünün çoğu, hücre içi koşullar altında 1 saniyeden daha az bir sürede döteryum için hidrojeni tamamen değiştirmiştir. Birkaç laboratuvar şimdi hızlı karıştırma enstrümantasyonu inşa etti; Bu durumda, 50 ms’lik bir ölü zaman ve 1 ms’lik bir zamansal çözünürlük ile HDX-MS’yi gerçekleştirebilen prototip bir hızlı karıştırma söndürme-akışcihazı kullanılır. Milisaniye HDX-MS son zamanlarda aSyn çalışmasında akut olarak önemli olsa da, özünde düzensiz proteinlerin / bölgelerin daha yaygın olarak ve sadece zayıf derecede kararlı olan döngüleri / bölgeleri olan çok sayıda proteinin incelenmesinde değerli olduğu görülmektedir. Örneğin, peptit ilaçları (örneğin, insülin; GLP-1/glukagon ; tirzepatid) ve peptid-füzyon proteinleri (örneğin, HIV inhibitörü FN3-L35-T1144), çözelti fazı yapısal ve stabilite bilgisinin ilaç geliştirme kararları için kritik bir girdi olabileceği başlıca ilaç formatlarıdır ve yine de, peptid moiety genellikle HDX-MS tarafından saniyeler zaman ölçeğinde zayıf bir şekilde stabil ve inatçıdır16,17,18,19,20 saniye zaman çizelgesinde HDX-MS tarafından inatçıdır. . Saniye/dakika alanlarında etiketleme ile ortaya çıkan HDX-MS yöntemlerinin DNA G-dörtlüleri için yapısal bilgi elde ettiği gösterilmiştir, ancak milisaniye HDX-MS21 uygulaması ile bunu daha çeşitli oligonükleotid yapılarına genişletmek mümkün olmalıdır.

HDX-MS deneyleri üç farklı seviyede gerçekleştirilebilir: (1) aşağıdan yukarıya (etiketli proteinin proteolitik olarak sindirildiği), (2) orta-aşağı (etiketli proteinin proteolitik olarak sindirildiği ve elde edilen peptitlerin yumuşak parçalanma teknikleriyle daha da parçalandığı) ve (3) yukarıdan aşağıya (yumuşak parçalanma tekniklerinin etiketli proteini doğrudan parçaladığı)22 . Bu nedenle, alt moleküler HDX-MS verileri, değişim davranışını bir proteinin belirli bölgelerine lokalize etmemize izin verir ve bu tür deneyler için yeterli dizi kapsamına sahip olmayı kritik hale getirir. Herhangi bir HDX-MS deneyinin yapısal çözünürlüğü, sırasıyla sindirim veya yumuşak parçalanma üzerine proteinden türetilen proteolitik peptitlerin veya fragmanların sayısına dayanır. Yukarıda özetlenen üç deney tipinin her birinde, her bir peptit / fragmandaki amid değişimindeki değişim, proteinin lokalize bölgelerinin davranışını belirtmek için proteinin birincil yapısına geri eşlenir. En yüksek yapısal çözünürlük yumuşak parçalanma yoluyla elde edilirken, bu deneylerin tanımı, aSyn monomer konformasyonlarının ölçümüne odaklanan mevcut çalışmanın kapsamı dışındadır. Burada açıklanan yaygın olarak uygulanan “aşağıdan yukarıya” iş akışı ile mükemmel sonuçlar elde edilebilir.

Burada, (1) aSyn örneklerinin ve HDX-MS tamponlarının nasıl hazırlanacağı ve işleneceği, (2) aşağıdan yukarıya HDX-MS deneyi için peptid haritalamanın nasıl gerçekleştirileceği, (3) monomerik aSyn üzerinde HDX-MS verilerinin fizyolojik koşullar altında, özellikle milisaniye zaman alanında nasıl elde edileceği (özel yapım bir cihaz kullanılarak; milisaniye etiketleme için alternatif araçlar da tanımlanmıştır), ve (4) HDX-MS verilerinin nasıl işleneceği ve analiz edileceği. Monomerik aSyn’in fizyolojik pH’ta (7.40) iki çözelti koşulunda kullanıldığı yöntemler burada örneklendirilmiştir. ASIN çalışmasında kritik derecede yararlı olsa da, bu prosedürler herhangi bir proteine uygulanabilir ve özünde düzensiz proteinlerle sınırlı değildir.

Protocol

1. Protein ekspresyonu ve aSyn’in saflaştırılması Daha önce yayınlanmış bir rapor9’u takiben aSyn’i hazırlayın. Güvenli bir depolama tamponuna diyaliz yapın (örneğin, Tris, pH 7.2). Gerekirse, numuneyi konsantre edin (örneğin, yaklaşık 10-30 dakika boyunca 3 kDa MWCO, 14.000 x g kullanarak spin filtre mikrosantrifüj tüpleri, bkz.NOT: Aşırı konsantre olunmaması tavsiye edilir. Monomer topluluğunun …

Representative Results

İçsel olarak düzensiz doğası nedeniyle, fizyolojik pH’ta aSyn’deki karmaşık yapısal değişiklikleri yakalamak zordur. HDX-MS, omurga amid hidrojenlerindeki izotopik değişimi izler ve protein konformasyonel dinamiklerini ve etkileşimlerini araştırır. Bu bilgiyi yüksek yapısal ve zamansal çözünürlüklerde elde etmek için kullanılan birkaç teknikten biridir. Bu protokol, çok çeşitli proteinlere ve tampon koşullarına geniş çapta uygulanabilir ve bu, aSyn’in değişim kinetiğinin iki farklı ç…

Discussion

Bu makalede, aşağıdaki prosedürler açıklanmaktadır: (1) en yüksek sekans kapsamını elde etmek için monomerik aSyn üzerinde peptid haritalama deneyleri yapmak, (2) fizyolojik koşullar altında monomerik aSyn üzerinde milisaniye HDX-MS verilerinin elde edilmesi ve (3) elde edilen HDX-MS verilerinin veri analizi ve yorumlanması gerçekleştirilmiştir. Sağlanan prosedürlerin uygulanması genellikle basittir, her etiketleme deneyi tipik olarak üç çoğaltma ve sekiz zaman noktası için yalnızca 8 saat s?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NS, Üniversite Konseyi Elmas Jübile Bursu tarafından finanse edilmektedir. JJP, UKRI Geleceğin Liderleri Bursu [Hibe numarası: MR/T02223X/1] tarafından desteklenmektedir.

Materials

1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column  Waters Corporation 186002346 Analytical column
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv VWR 20060.420 For LC mobile phases
CaCl2 Sigma Aldrich C5670 Salt for HDX buffers
Chronos Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) 667006090 Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell
Deuterium chloride Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-2-50 For HDX labelling buffers
Deuterium oxide (99.9% D2O) Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-4 Deuterated water
DynamX 3.0 Waters Corporation 176016027 Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation
Enzymate BEH Pepsin Column Waters Corporation 186007233 Pepsin digestion column
Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade Fisher Scientific 10596814 For LC mobile phases
Guanidinium hydrochloride Sigma Aldrich RDD001-500G Chaotrope/Denaturant
HDfleX University of Exeter N/A https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KCl Sigma Aldrich P3911 Salt for HDX buffers
LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot Waters Corporation 725000637 Autosampler robot
Leucine enkephalin Waters Corporation 186006013 For mass spectrometry lockspray calibration.
MassLynx Waters Corporation 667004007 Software controlling inlet methods and mass spectrometer
Maximum recovery vials Waters Corporation 600000670CV 100 pack including caps – used for quench tray in LEAP HDX-2
MgCl2 Sigma Aldrich M8266 Salt for HDX buffers
Millipore 0.22 µm syringe filters Millipore N9CA7069B Syringe filters
ms2min Applied Photophysics Ltd N/A fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument
NaCl Sigma Aldrich S9888 Salt for HDX buffers
Peltier temperature controller LEAP Technologies Inc. HP115-COOL/D Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.
ProteinLynx Global Server 3.0 Waters Corporation 715001030 Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.
Reagent pot caps Waters Corporation 186004632 100 pack
Reagent pots for LEAP HDX-2 Waters Corporation 186001420 100 pack excluding caps – used for buffers in LEAP HDX-2
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-57 For HDX labelling buffers
Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) Amicon (Merck Sigma Aldrich) UFC5003 Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.
Synapt G2-Si mass spectrometer Waters Corporation 176850035 Mass spectrometer
Total recovery vials Waters Corporation 600000671CV 100 pack including caps – used for labelling tray in LEAP HDX-2
Tris-HCl Sigma Aldrich T3253-250G Buffer
Trizma base Sigma Aldrich T60040-B2005 Buffer
Urea Sigma Aldrich U5378-1KG Chaotrope/Denaturant
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column  Waters Corporation 186004623 Trap desalting column
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson’s disease, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
  2. Breydo, L., Wu, J. W., Uversky, V. N. α-Synuclein misfolding and Parkinson’s disease. Biochimica et Biophysica Acta (BBA): Molecular Basis of Disease. 1822 (2), 261-285 (2012).
  3. Dedmon, M. M., Lindorff-Larsen, K., Christodoulou, J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. Mapping long-range interactions in α-synuclein using spin-label NMR and ensemble molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 127 (2), 476-477 (2005).
  4. Esteban-Martín, S., Silvestre-Ryan, J., Bertoncini, C. W., Salvatella, X. Identification of fibril-like tertiary contacts in soluble monomeric α-synuclein. Biophysical Journal. 105 (5), 1192-1198 (2013).
  5. McClendon, S., Rospigliosi, C. C., Eliezer, D. Charge neutralization and collapse of the C-terminal tail of alpha-synuclein at low pH. Protein Science. 18 (7), 1531-1540 (2009).
  6. Ranjan, P., Kumar, A. Perturbation in long-range contacts modulates the kinetics of amyloid formation in α-synuclein familial mutants. ACS Chemical Neuroscience. 8 (10), 2235-2246 (2017).
  7. Villar-Piqué, A., da Fonseca, T. L., Outeiro, T. F. Structure, function and toxicity of alpha-synuclein: the Bermuda triangle in synucleinopathies. Journal of Neurochemistry. 139, 240-255 (2015).
  8. Seetaloo, N., Zacharopoulou, M., Stephens, A. D., Schierle, G. S. K., Phillips, J. J. Local structural dynamics of alpha-synuclein correlate with aggregation in different physiological conditions. bioRxiv. , (2022).
  9. Stephens, A. D., et al. Extent of N-terminus exposure of monomeric alpha-synuclein determines its aggregation propensity. Nature Communications. 11 (1), 2820 (2020).
  10. Stephens, A. D., et al. Different structural conformers of monomeric α-synuclein identified after lyophilizing and freezing. Analytical Chemistry. 90 (11), 6975-6983 (2018).
  11. Lautenschläger, J., et al. C-terminal calcium binding of α-synuclein modulates synaptic vesicle interaction. Nature Communications. 9 (1), 712 (2018).
  12. Oganesyan, I., Lento, C., Tandon, A., Wilson, D. J. Conformational dynamics of α-synuclein during the interaction with phospholipid nanodiscs by millisecond hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (5), 1169-1179 (2021).
  13. Keppel, T. R., Weis, D. D. Analysis of disordered proteins using a simple apparatus for millisecond quench-flow H/D exchange. Analytical Chemistry. 85 (10), 5161-5168 (2013).
  14. Al-Naqshabandi, M. A., Weis, D. D. Quantifying protection in disordered proteins using millisecond hydrogen exchange-mass spectrometry and peptic reference peptides. Biochemistry. 56 (31), 4064-4072 (2017).
  15. Kish, M., et al. Allosteric regulation of glycogen phosphorylase solution phase structural dynamics at high spatial resolution. bioRxiv. , (2019).
  16. El-Amine, M., et al. Mechanisms of tolerance induction by a gene-transferred peptide-IgG fusion protein expressed in B lineage cells. Journal of Immunology. 165 (10), 5631-5636 (2000).
  17. Kishimoto, S., et al. Site-specific chemical conjugation of antibodies by using affinity peptide for the development of therapeutic antibody format. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 698-702 (2019).
  18. Xu, W., et al. A protein-based, long-acting HIV-1 fusion inhibitor with an improved pharmacokinetic profile. Pharmaceuticals. 15 (4), 424 (2022).
  19. Frías, J. P., et al. Tirzepatide versus semaglutide once weekly in patients with type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (6), 503-515 (2021).
  20. Gerstein, H. C., et al. Cardiovascular and renal outcomes with efpeglenatide in type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (10), 896-907 (2021).
  21. Largy, E., Gabelica, V. Native hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry of structured DNA oligonucleotides. Analytical Chemistry. 92 (6), 4402-4410 (2020).
  22. Marcsisin, S. R., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry: What is it and what can it tell us. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 967-972 (2010).
  23. Glasoe, P. K., Long, F. A. Use of glass electrodes to measure acidities in deuterium oxide. Journal of Physical Chemistry. 64 (1), 188-190 (1960).
  24. Krȩzel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  25. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., Popp, J. The Bouguer-Beer-Lambert law: Shining light on the obscure. ChemPhysChem. 21 (18), 2029-2046 (2020).
  26. Gasteiger, E., et al. . The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
  27. Bateman, R. H., et al. A novel precursor ion discovery method on a hybrid quadrupole orthogonal acceleration time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer for studying protein phosphorylation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 13 (7), 792-803 (2002).
  28. Sørensen, L., Salbo, R. Optimized workflow for selecting peptides for HDX-MS data analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (11), 2278-2281 (2018).
  29. Demmers, J. A. A., Rijkers, D. T. S., Haverkamp, J., Killian, J. A., Heck, A. J. R. Factors affecting gas-phase deuterium scrambling in peptide ions and their implications for protein structure determination. Journal of the American Chemical Society. 124 (37), 11191-11198 (2002).
  30. Seetaloo, N., Kish, M., Phillips, J. J. HDfleX: Software for flexible high structural resolution of hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry data. Analytical Chemistry. 94 (11), 4557-4564 (2022).
  31. Hageman, T. S., Weis, D. D. Reliable identification of significant differences in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements using a hybrid significance testing approach. Analytical Chemistry. 91 (13), 8008-8016 (2019).
  32. Hageman, T. S., Weis, D. D. A structural variant approach for establishing a detection limit in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements. Analytical Chemistry. 91 (13), 8017-8024 (2019).
  33. Chetty, P. S., et al. Helical structure and stability in human apolipoprotein A-I by hydrogen exchange and mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19005-19010 (2009).
  34. Keppel, T. R., Weis, D. D. Mapping residual structure in intrinsically disordered proteins at residue resolution using millisecond hydrogen/deuterium exchange and residue averaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 547-554 (2015).
  35. Li, J., Rodnin, M. V., Ladokhin, A. S., Gross, M. L. Hydrogen-deuterium exchange and mass spectrometry reveal the pH-dependent conformational changes of diphtheria toxin T domain. Biochemistry. 53 (43), 6849-6856 (2014).
  36. Roder, H., Elöve, G. A., Englander, S. W. Structural characterization of folding intermediates in cytochrome c by H-exchange labelling and proton NMR. Nature. 335 (6192), 700-704 (1988).
  37. Rob, T., et al. Measuring dynamics in weakly structured regions of proteins using microfluidics-enabled subsecond H/D exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (8), 3771-3779 (2012).
  38. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13 (13), 2528-2532 (2013).
  39. Svejdal, R. R., Dickinson, E. R., Sticker, D., Kutter, J. P., Rand, K. D. Thiol-ene microfluidic chip for performing hydrogen/deuterium exchange of proteins at subsecond time scales. Analytical Chemistry. 91 (2), 1309-1317 (2018).
  40. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  41. Coales, S. J., E, S. Y., Lee, J. E., Ma, A., Morrow, J. A., Hamuro, Y. Expansion of time window for mass spectrometric measurement of amide hydrogen/deuterium exchange reactions. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (24), 3585-3592 (2010).
  42. Hoyer, W., et al. Dependence of alpha-synuclein aggregate morphology on solution conditions. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 383-393 (2002).
  43. Rand, K. D., Pringle, S. D., Morris, M., Engen, J. R., Brown, J. M. ETD in a traveling wave ion guide at tuned Z-spray ion source conditions allows for site-specific hydrogen/deuterium exchange measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22 (10), 1784-1793 (2011).
  44. Kan, Z. Y., Ye, X., Skinner, J. J., Mayne, L., Englander, S. W. ExMS2: An integrated solution for hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry data analysis. Analytical Chemistry. 91 (11), 7474-7481 (2019).
  45. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Characterizing short-lived protein folding intermediates by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (20), 8591-8597 (2010).
  46. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  47. Mistarz, U. H., et al. Photodissociation mass spectrometry accurately localizes sites of backbone deuteration in peptides. Analytical Chemistry. 90 (2), 1077-1080 (2017).
  48. Phillips, J. J., et al. Rate of asparagine deamidation in a monoclonal antibody correlating with hydrogen exchange rate at adjacent downstream residues. Analytical Chemistry. 89 (4), 2361-2368 (2017).

Tags

Alpha-synucleinHydrogen/deuterium ExchangeMass SpectrometryIntrinsically Disordered ProteinsPeptide MappingSample PreparationAutosamplerHDX RoboticsQuench BufferPeptide Coverage MapFast HDX Prototype InstrumentHDX Data Analysis Software

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions. J. Vis. Exp. (184), e64050, doi:10.3791/64050 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image