Millisekunden-Wasserstoff/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Untersuchung der Alpha-Synuclein-Strukturdynamik unter physiologischen Bedingungen

Die Parkinson-Krankheit (PD) ist eine neurodegenerative Erkrankung, von der weltweit Millionen von Menschen betroffen^{sind 1}. Es ist gekennzeichnet durch die Bildung von zytoplasmatischen Einschlüssen, die als Lewy-Körper und Lewy-Neuriten in der Substantia nigra pars compacta-Region des Gehirns bekannt sind. Es wurde festgestellt, dass diese zytoplasmatischen Einschlüsse Aggregate des intrinsisch ungeordneten Proteins aSyn² enthalten. Bei PD und anderen Synucleinopathien wandelt sich aSyn von einem löslichen ungeordneten Zustand in einen unlöslichen, hochstrukturierten Krankheitszustand um. In seiner nativen Form nimmt das monomere aSyn eine breite Palette von Konformationen an, die durch langreichweitige elektrostatische Wechselwirkungen zwischen seinen N- und C-Termini und hydrophobe Wechselwirkungen zwischen seinem C-Terminus und der Nicht-Amyloid-Beta-Komponente (NAC) Region 3,4,5,6 stabilisiert werden. Alle Störungen in diesen stabilisierenden Interaktionen, wie Mutationen, posttranslationale Modifikationen und Veränderungen in der lokalen Umgebung, können zur Fehlfaltung des Monomers führen und so den Prozess der Aggregation auslösen⁷.

Während eine große Menge an Forschung über die oligomeren und fibrillären Formen von aSyn 8,9,10,11 existiert^, besteht ein entscheidender Bedarf, die monomere Form des Proteins zu untersuchen und besser zu verstehen, welche Konformer funktionell sind (und wie) und welche anfällig für Aggregate^sind 8,9,10,11 . Da das aSyn-Monomer intrinsisch ungeordnet ist, nur 14 kDa groß ist und schwer zu kristallisieren ist, ist es für die meisten strukturbiologischen Techniken nicht zugänglich. Eine Technik, die in der Lage ist, die Konformationsdynamik des monomeren aSyn zu messen, ist jedoch die Millisekunde HDX-MS, die in letzter Zeit wichtige strukturelle Beobachtungen hervorgebracht hat, die sonst schwierig oder unmöglich zu erhalten^{wären 12,13,14}. Die Millisekunde HDX-MS misst sensitiv den Durchschnitt des Proteinkonformationsensembles, indem sie den Isotopenaustausch an Amidwasserstoffen überwacht und die Zugänglichkeit von Lösungsmitteln und die Beteiligung des Wasserstoffbrückennetzwerks einer bestimmten Proteinregion auf der Millisekunden-Zeitskala anzeigt. Es ist notwendig, den Millisekundenaspekt des HDX-MS hervorzuheben, da aSyn aufgrund seiner nativ entfalteten, metastabilen Natur eine sehr schnelle Wasserstoffaustauschkinetik aufweist, die sich deutlich unter der unteren Grenze herkömmlicher HDX-MS-Systeme manifestiert. Zum Beispiel hat der größte Teil des aSyn-Moleküls Wasserstoff unter intrazellulären Bedingungen in weniger als 1 s vollständig gegen Deuterium ausgetauscht. Mehrere Labore haben inzwischen Schnellmischgeräte gebaut; In diesem Fall wird ein Prototyp eines schnell mischenden Quench-Flow-Instruments verwendet, das HDX-MS mit einer Totzeit von 50 ms und einer zeitlichen Auflösung von 1 ms ausführen kann¹⁵. Während Millisekunden-HDX-MS in letzter Zeit bei der Untersuchung von aSyn akut wichtig war, ist es wertvoll für die Untersuchung von intrinsisch ungeordneten Proteinen / Regionen im weiteren Sinne und einer großen Anzahl von Proteinen mit Schleifen / Regionen, die nur schwach stabil sind. Zum Beispiel Peptidarzneimittel (z. B. Insulin; GLP-1/Glucagon; Tirzepatid) und Peptidfusionsproteine (z. B. der HIV-Inhibitor FN3-L35-T1144) sind wichtige Arzneimittelformate, in denen Struktur- und Stabilitätsinformationen der Lösungsphase ein kritischer Input für Entscheidungen zur Arzneimittelentwicklung sein können, und dennoch ist die Peptideinheit durch HDX-MS auf der Sekundenskala 16,17,18,19,20 oft nur schwach stabil und hartnäckig. . Es hat sich gezeigt, dass emergente HDX-MS-Methoden mit Markierung in den Sekunden/Minuten-Domänen strukturelle Informationen für DNA-G-Quadruplexe ableiten, aber es sollte möglich sein, diese durch die Anwendung von Millisekunden-HDX-MS²¹ auf vielfältigere Oligonukleotidstrukturen auszudehnen.

HDX-MS-Experimente können auf drei verschiedenen Ebenen durchgeführt werden: (1) bottom-up (wobei das markierte Protein proteolytisch verdaut wird), (2) Middle-Down (wobei das markierte Protein proteolytisch verdaut wird und die resultierenden Peptide durch Soft-Fragmentierungstechniken weiter fragmentiert werden) und (3) Top-Down (wobei Soft-Fragmentierungstechniken das markierte Protein direkt fragmentieren)²² . Submolekulare HDX-MS-Daten ermöglichen es uns daher, das Austauschverhalten auf bestimmte Regionen eines Proteins zu lokalisieren, was es für solche Experimente entscheidend macht, eine ausreichende Sequenzabdeckung zu haben. Die strukturelle Auflösung eines HDX-MS-Experiments hängt von der Anzahl der proteolytischen Peptide oder Fragmente ab, die bei der Verdauung bzw. Weichfragmentierung aus dem Protein stammen. In jedem der drei oben beschriebenen Experimenttypen wird die Änderung des Amidaustauschs an jedem Peptid / Fragment auf die Primärstruktur des Proteins zurückgebildet, um das Verhalten lokalisierter Regionen des Proteins anzuzeigen. Während die höchste strukturelle Auflösung durch Soft-Fragmentierung erreicht wird, liegt die Beschreibung dieser Experimente außerhalb des Rahmens der aktuellen Studie, die sich auf die Messung von aSyn-Monomer-Konformationen konzentriert. Hervorragende Ergebnisse können mit dem hier beschriebenen häufig angewendeten “Bottom-up”-Workflow erzielt werden.

Hier werden Verfahren zur Verfügung gestellt, (1) wie man aSyn-Proben und HDX-MS-Puffer vorbereitet und handhabt, (2) wie man ein Peptid-Mapping für ein Bottom-up-HDX-MS-Experiment durchführt, (3) wie man HDX-MS-Daten auf monomerem aSyn unter physiologischen Bedingungen, insbesondere im Millisekunden-Zeitbereich, erfasst (mit einem speziell angefertigten Instrument; alternative Instrumente zur Millisekundenmarkierung wurden ebenfalls beschrieben), und (4) wie die HDX-MS-Daten verarbeitet und analysiert werden. Methoden zur Verwendung von monomerem aSyn bei physiologischem pH-Wert (7,40) in zwei Lösungsbedingungen werden hier veranschaulicht. Obwohl diese Verfahren für die Untersuchung von aSyn von entscheidender Bedeutung sind, können sie auf jedes Protein angewendet werden und sind nicht auf intrinsisch ungeordnete Proteine beschränkt.