Espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio de milisegundos para el estudio de la dinámica estructural de la alfa-sinucleína en condiciones fisiológicas

La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a millones de personas en todo el mundo¹. Se caracteriza por la formación de inclusiones citoplasmáticas conocidas como cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy en la región de la sustancia negra pars compacta del cerebro. Se ha encontrado que estas inclusiones citoplasmáticas contienen agregados de la proteína intrínsecamente desordenada aSyn². En la EP y otras sinucleinopatías, aSyn se transforma de un estado desordenado soluble en un estado enfermo insoluble y altamente estructurado. En su forma nativa, aSyn monomérico adopta una amplia gama de conformaciones estabilizadas por interacciones electrostáticas de largo alcance entre su N- y C-termini e interacciones hidrofóbicas entre su región C-terminal y el componente beta no amiloide (NAC) 3,4,5,6. Cualquier interrupción en esas interacciones estabilizadoras, como mutaciones, modificaciones post-traduccionales y cambios en el entorno local, puede conducir al plegamiento incorrecto del monómero, desencadenando así el proceso de agregación⁷.

Si bien existe una gran cantidad de investigación sobre las formas oligomérica y fibrilar de aSyn 8,9,10,11, existe una necesidad crucial de estudiar la forma monomérica de la proteína y comprender mejor qué conformadores son funcionales (y cómo) y cuáles son propensos a agregar 8,9,10,11 . Al ser intrínsecamente desordenado, de solo 14 kDa de tamaño y difícil de cristalizar, el monómero aSyn no es susceptible a la mayoría de las técnicas biológicas estructurales. Sin embargo, una técnica capaz de medir la dinámica conformacional de aSyn monomérico es el HDX-MS de milisegundos, que recientemente ha generado importantes observaciones estructurales que serían desafiantes o imposibles de obtener de otra manera 12,13,14. Millisegundo HDX-MS mide sensiblemente el promedio del conjunto conformacional de proteínas mediante el monitoreo del intercambio isotópico en hidrógenos amida, lo que indica la accesibilidad al solvente y la participación en la red de enlace de hidrógeno de una región proteica particular en la escala de tiempo de milisegundos. Es necesario enfatizar el aspecto de milisegundos del HDX-MS ya que, debido a su naturaleza metaestable y desplegada de forma nativa, aSyn exhibe una cinética de intercambio de hidrógeno muy rápida que se manifiesta muy por debajo del límite inferior de los sistemas HDX-MS convencionales. Por ejemplo, la mayor parte de la molécula aSyn ha intercambiado completamente hidrógeno por deuterio en condiciones intracelulares en menos de 1 s. Varios laboratorios han construido instrumentación de mezcla rápida; en este caso, se utiliza un prototipo de instrumento de flujo de enfriamiento de mezcla rápida capaz de realizar HDX-MS con un tiempo muerto de 50 ms y una resolución temporal de 1 ms¹⁵. Si bien HDX-MS de milisegundos ha sido recientemente muy importante en el estudio de aSyn, puede ser valioso para estudiar proteínas / regiones intrínsecamente desordenadas más ampliamente y una gran cantidad de proteínas con asas / regiones que solo son débilmente estables. Por ejemplo, medicamentos peptídicos (por ejemplo, insulina; GLP-1/glucagón; tirzepatida) y las proteínas de fusión peptídica (por ejemplo, el inhibidor del VIH FN3-L35-T1144) son los principales formatos de fármacos en los que la información estructural y de estabilidad en fase de solución puede ser un insumo crítico para las decisiones de desarrollo de fármacos y, sin embargo, la fracción peptídica a menudo solo es débilmente estable e intratable por HDX-MS en la escala de tiempo de segundos 16,17,18,19,20 . Se ha demostrado que los métodos emergentes HDX-MS con etiquetado en los dominios de segundos/minutos derivan información estructural para los G-cuadrúplex de ADN, pero debería ser posible extender esto a estructuras de oligonucleótidos más diversas mediante la aplicación de HDX-MS²¹ de milisegundos.

Los experimentos hdX-MS se pueden realizar en tres niveles diferentes: (1) de abajo hacia arriba (por lo que la proteína marcada se digiere proteolíticamente), (2) de medio hacia abajo (por lo que la proteína marcada se digiere proteolíticamente y los péptidos resultantes se fragmentan aún más mediante técnicas de fragmentación suave) y (3) de arriba hacia abajo (mediante la cual las técnicas de fragmentación suave fragmentan directamente la proteína marcada)²² . Por lo tanto, los datos submoleculares de HDX-MS nos permiten localizar el comportamiento de intercambio a regiones específicas de una proteína, por lo que es fundamental tener una cobertura de secuencia adecuada para tales experimentos. La resolución estructural de cualquier experimento HDX-MS se basa en el número de péptidos proteolíticos o fragmentos derivados de la proteína en la digestión o la fragmentación suave, respectivamente. En cada uno de los tres tipos de experimentos descritos anteriormente, el cambio en el intercambio de amida en cada péptido / fragmento se mapea de nuevo en la estructura primaria de la proteína para indicar el comportamiento de las regiones localizadas de la proteína. Si bien la resolución estructural más alta se logra a través de la fragmentación suave, la descripción de estos experimentos está fuera del alcance del estudio actual, que se centra en la medición de conformaciones de monómeros aSyn. Se pueden obtener excelentes resultados con el flujo de trabajo “de abajo hacia arriba” comúnmente aplicado que se describe aquí.

Aquí, se proporcionan procedimientos sobre (1) cómo preparar y manejar muestras de aSyn y búferes HDX-MS, (2) cómo realizar el mapeo de péptidos para un experimento HDX-MS de abajo hacia arriba, (3) cómo adquirir datos HDX-MS en aSyn monomérico en condiciones fisiológicas, específicamente en el dominio del tiempo de milisegundos (utilizando un instrumento personalizado; también se han descrito instrumentos alternativos para el etiquetado de milisegundos), y (4) cómo procesar y analizar los datos de HDX-MS. Los métodos que utilizan aSyn monomérico a pH fisiológico (7.40) en dos condiciones de solución se ejemplifican aquí. Si bien son críticamente útiles en el estudio de aSyn, estos procedimientos se pueden aplicar a cualquier proteína y no se limitan a proteínas intrínsecamente desordenadas.