長さスケール全体で染色体コンフォメーションをキャプチャする

1.架橋による固定 ホルムアルデヒド固定:単層の細胞から出発細胞を適切な培地に播種して、150mmプレートあたり5×106 細胞を回収する。注:ユーザーは、任意の哺乳類細胞株の最適な増殖を保証する任意の好ましい容器を選択することができます。さらに、細胞は組織から単離することができる。 150 mmプレートから真空トラップに結合したパスツールピペットで培地を吸引し、~10 mL HBSSで2回洗浄します。 架橋の直前に、22.5 mLのHBSSと625 μLの37を最終濃度1%まで組み合わせて、50 mLチューブに1架橋溶液を調製します。揺り動かして穏やかに混ぜます。注意: ヒュームフードを使用してください。ホルムアルデヒドは有毒です。 細胞を架橋するには、23.125 mLの1溶液を各15 cmプレートに注ぎます。 室温で10分間インキュベートし、2分ごとに手でプレートを静かに揺り動かします。 1.25 mLの2.5 Mグリシン(最終128 mM)を加え、プレートを静かに回転させて架橋反応を消光します。 室温で5分間インキュベートし、氷上で少なくとも15分間インキュベートして架橋を停止します。 セルスクレーパーまたはゴム製の警官でプレートからセルをこすります。 細胞懸濁液をピペット付きの50 mLコニカルチューブに移します。室温で1,000×gで10分間遠心分離し、吸引により上清を廃棄します。 細胞ペレットを10 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で1回洗浄し、ピペットを使用して再懸濁します。その後、室温で1,000 × g で10分間遠心分離します。すぐにDSG架橋に進みます。注意: 細胞ペレットを洗うときは、細胞ペレットが緩んで細胞が失われる可能性があるため、注意してください。 ホルムアルデヒド固定:懸濁中の細胞から始める細胞を適切な培地に播種して、1容器あたり5×106 細胞を回収する。注:ユーザーは、任意の哺乳類細胞株の最適な細胞増殖を保証する任意の好ましい容器を選択できます。 収穫直前に細胞を数え、5 × 106 細胞を50 mLのコニカルチューブに移します。 室温で10分間300 × g で遠心分離することにより、細胞を穏やかにペレット化します。 HBSS45mLに1.25mLの37を加えて1架橋液を調製し、チューブを数回反転させて混合します。注:量を分割せずに1.25mLのFA全体を追加します。注意: ホルムアルデヒドは非常に有毒です。 前工程で調製した46.25 mLの1架橋溶液に細胞ペレットを上下にピペッティングして再懸濁する。 室温でローテーター、ロッカーで正確に10分間、または1〜2分ごとにチューブを穏やかに手動で反転させてインキュベートします。 2.5 mLの2.5 Mグリシン(最終128 mM)を加えて架橋反応をクエンチし、チューブを反転させてよく混合します。 室温で5分間インキュベートした後、氷上で少なくとも15分間インキュベートして、架橋を完全に停止します。 室温で遠心分離し、架橋細胞を1,000 × g で10分間ペレット化し、吸引により上清を廃棄します。 細胞を10 mLのDPBSで1回洗浄した後、室温で1,000 × g で10分間遠心分離します。ピペットを使用して上清を完全に廃棄し、直ちにDSG架橋に進みます。注意: 細胞ペレットを洗うときは、細胞ペレットが緩んで細胞が失われる可能性があるため、注意してください。 ジスクシンイミジルグルタル酸による架橋ペレット化した細胞を9.9 mLのDPBSに再懸濁してから、100 μLの300 mM DSG(3 mM最終)を加えます。反転で混ぜます。注意: DSGは湿気に敏感です。架橋の日にDMSOで300 mM DSGの新鮮なストックを準備することが重要です。注意: DMSOのDSGは非常に有毒です。 細胞をローテーター上で室温で40分間架橋します。 1.925 mLの2.5 Mグリシン(最終400 mM)を加え、転倒させて混合し、室温で5分間インキュベートします。 細胞を2,000 × g で室温で15分間遠心分離します。注:緩い細胞ペレットから上清を除去するときは注意してください。 ペレットを1 mLの0.05%ウシ血清アルブミン(BSA)-DPBSに再懸濁し、1.7 mLチューブに移します。注:BSAを添加すると、細胞の凝集を減らすのに役立ちます。 細胞を2,000 × g で4°Cで15分間遠心分離し、ピペットで上清を除去します。注:ペレットの損失を避けるために、上清を迅速かつ完全に除去します。 ペレットを液体窒素で急速凍結し、-80°Cで保存するか、すぐに次のステップに進みます。 2. 染色体立体構造捕捉 細胞溶解とクロマチン消化架橋細胞アリコート(~5 × 106 細胞)を、10 μLのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む1 mLの氷冷溶解バッファー( 補足表S1のレシピ)に再懸濁(ピペット)し、ダウンスホモジナイザーに移して氷上で15分間インキュベートします。注:使用直前にプロテアーゼ阻害剤を溶解バッファーに追加します。 乳棒Aをゆっくりと上下に30回動かして氷上で細胞を均質化し、氷上で1分間インキュベートして細胞を冷ましてから、さらに30ストロークします。 ライセートを1.7 mLのマイクロ遠心チューブに移します。注意: 細胞がピペットチップにくっつくことがあるので、懸濁液を動かし続けてください。 溶解した懸濁液を2,500 × g で室温で5分間遠心分離します。 上清を廃棄し、湿ったペレットをフリックまたはボルテックスして再懸濁する。できるだけ多くの上清を取り除き、塊を最小限に抑えたヨーグルト様物質を得る。 ペレットを500 μLの氷冷1x制限バッファー(10xから; 補足表S1のレシピを参照)に再懸濁し、2,500 × gで5分間遠心分離します。この手順を繰り返して、2回目の洗浄を行います。注:1x制限バッファーのペレットは、溶解バッファーの以前のペレットよりも粒状です。 細胞サイズに応じて、ペレットのキャリーオーバー容量に~340 μLを加えた後、ピペッティングにより、最終容量360 μLの1x制限バッファーに細胞を再懸濁します。 クロマチンインテグリティ(CI)をテストするために、各ライセート18 μLを確保します。CIサンプルは4°Cで保存してください。 各Hi-Cチューブに38 μLの1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を加え(総容量380 μL)、気泡を導入せずにピペッティングで慎重に混合します。注意: SDSは有毒です。 サンプルを65°Cで正確に10分間振とうせずにインキュベートし、クロマチンを開きます。 すぐにチューブを氷の上に置き、 表1に記載されているように、Triton X-100で消化混合物を調製してSDSを急冷します。 107 μLの消化混合物をHi-Cチューブ(合計487 μL)に加え、インターバル振とう(例:900 rpm、30秒オン、4分オフ)のサーモミキサーでクロマチンを37°Cで一晩(~16時間)消化します。注:最終濃度1%にトリトンを添加すると、SDSを消光するのに役立ちます。 DNA末端のビオチン化一晩消化した後、サンプルを65°Cで20分間移し、残りのエンドヌクレアーゼ活性を失活させます。 インキュベーション中に、 表2に示すようにフィルインマスターミックスを調製する。 インキュベーション後、サンプルをすぐに氷の上に置きます。 各サンプルに10 μLの消化コントロール(DC)を用意し、4°Cで保存します。 ピペットまたは回転させて蓋から結露を取り除きます。各サンプルに、58 μLのビオチンフィルインミックス(総サンプル容量535 μL)を加え、気泡を形成せずに穏やかにピペットします。 サンプルをサーモミキサーで23°Cで4時間インキュベートします(例:900 rpm、30秒オン、4分オフ)。 近位DNA断片のライゲーションビオチンフィルインがインキュベートしている間に 表3 に示すようにライゲーションミックスを調製する。 各サンプルに665 μLのライゲーションミックスを加えます(総サンプル量1,200 μL)。ピペッティングで穏やかに混ぜます。 サンプルを16°Cで4時間、インターバル振とうしながらサーモミキサーでインキュベートします(例:900 rpm、30秒オン、4分オフ)。共有結合したクロマチンを含むこれらのサンプルを4°Cで数日間保存します。 架橋の逆転CIおよびDCサンプルの容量を1xトリス低EDTA(TLE; 補足表S1のレシピを参照)で50μLにします。 10 μLの10 mg/mLプロテイナーゼKをCIおよびDCサンプルに加えます。 65°Cで一晩、インターバル振とう(例:900 rpm、30秒オン、4分オフ)でインキュベートします。あるいは、Hi-CサンプルのDNA精製中に、これらのコントロールに対して架橋の30分間の逆転を実行します。 各Hi-Cサンプルに50 μLの10 mg/mLプロテイナーゼKを加え、65°Cでインターバル振とうしながら少なくとも2時間インキュベートします(例:900 rpm、30秒オン、4分オフ)。 さらに50 μLの10 mg/mLプロテイナーゼKを各Hi-Cチューブ(総サンプル量1,300 μL)に加え、65°Cで一晩インキュベートを続けます。DNA精製まで4°Cで保存する。注:プロテイナーゼKインキュベーションを分割することで、タンパク質の総消化が保証されます。 DNA精製チューブを65°Cから室温まで冷却します。 各サンプルを15 mLのコニカルチューブに移し、2.6 mL(2倍容量)のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールを各チューブに加えます。注意:フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールは非常に有毒な刺激物であり、発がん性の可能性があります。 各チューブを1分間ボルテックスしてから、その内容物を15 mLのフェーズロックチューブに移します。 ベンチトップ遠心分離機で最高速度(1,500〜3,500 × g)でサンプルを5分間遠心分離します。 水相を35 mLの超遠心チューブに注意深く注ぎ、最終容量1,250 μLになるまで超純水を加えます。注意: チューブを使用して、利用可能な超遠心分離機に合わせるか、複数のマイクロ遠心チューブに分割します。 3 M酢酸ナトリウムの1/10番目の 容量(~125 μL)を加え、転倒してよく混合します。 各サンプルに2.5倍容量(~3.4 mL)の氷冷100%エタノールを加え、氷冷した100%エタノールを加えて超遠心分離用のチューブのバランスを取り、反転してよく混合します。 チューブをドライアイスで~15分間インキュベートします(固化を避けます)。 チューブを18,000 × g で4°Cで30分間遠心分離します。注意: 角度の付いたローターの場合:ペレットがある場所のチューブに印を付けます。 ピペットを使用して、非ペレット側から上清を完全に除去して廃棄します。注意: この時点で、ペレットは見えるようになり、次のステップで乾燥した後にはっきりと見えない可能性があるため、チューブにマークを付けることができます。 サンプルを約10分間、または目に見えて乾くまで風乾します。 各ペレットをピペッティングまたは旋回によって1x TLEの450 μLに可溶化し、分子量3 kDaのカットオフで0.5 mL遠心フィルターユニット(CFU)に移します。 CFUを最高速度で10分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。各超遠心チューブを追加450 μLの1x TLEで洗浄し、CFUに移して再度洗浄します。注:この方法でCFUを洗浄すると、塩分濃度を下げながらDNAの損失を制限します。 CFUを最高速度で10分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。 80 μLの1x TLEをカラムに加え、カラムを新しい回収チューブに回転させてから、最高速度で2分間遠心分離して、~100 μLの最終容量を得ます。 各サンプルに1 μLのRnaseA(1 mg/mL、10 mg/mLストックの10倍希釈)を加え、ヒートブロック、ウォーターバス、またはサーモミキサーで37°Cで少なくとも30分間インキュベートします。 Rnase処理後、サンプルを37°Cから取り出し、品質管理ステップまで4°Cで保存します。 クロマチン品質、酵素消化、サンプルライゲーションのチェックステップ2.4.5で架橋を反転させた後、CIおよびDCサンプルを室温まで冷却します。その後、予め紡糸した2 mLフェーズロックチューブに移します。注意: フェーズロックの内容物がペレットに遠心分離されていることを確認してください(最高速度2分間)。 フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール200 μLを加え、1分間ボルテックスしてサンプルを混合します。 チューブを最高速度で5分間遠心分離します。 各サンプル(~50 μL)の水相を新しい1.7 mLマイクロフュージチューブに移します。 1 μLのルナーゼA(1 mg/mLから)を加え、37°Cで少なくとも30分間インキュベートします。 表4で推奨されているように、サンプルを0.8%アガロースゲルにロードします。注: 品質管理から期待される結果を 図 2 に示します。 ゲルからのデンシトメトリー、またはキュービットまたはナノドロップを使用してDNAを定量します。注:正確な定量により、プロトコルの次の部分で正しい入力ボリュームが保証されます。既知の量を持つ複数の標準を使用して、検量線を作成します。 表1:消化試薬。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 表2:ビオチン充填試薬。 *酵素の変更には、異なるバッファーとビオチン化dNTPが必要になる場合があります。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 表3:ライゲーションミックス試薬。 略称:BSA =ウシ血清アルブミン。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 表4:品質およびサイズ選択評価のためのゲル負荷パラメータ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 図2:典型的なポストDNA精製精度管理結果を示すアガロースゲル 。 (A)CIコントロールは、高分子量のDNAのバンドを示す必要があります。(B)DCおよびHi-Cサンプルは、さまざまなDNAサイズを示しています。より大きな断片に結合されたHi-Cサンプルは、DCよりも高い分子量でなければなりません。マーカーの濃度範囲により、検量線を生成できます。この例では、CIは別のゲルにロードされていますが、すべてのサンプルとコントロールを一緒にロードして実行することをお勧めします。略語:CI =クロマチン完全性;DC =消化制御;Hi-C = 近接結紮。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 3. Hi-Cシーケンシングライブラリの調製 結紮されていない末端からのビオチンの除去表5に示すようにビオチン除去反応液を調製する。注:通常、10 μgのDNAで十分ですが、最大30 μgを使用できます。 各130 μL反応から2 x 65 μLのアリコートを2本のPCRチューブに分配します。 サーモサイクラーまたはPCRマシンに移し、 表5に記載のようにインキュベートします。注:サンプルは、4°C(数日から数週間)、-20°C(長期)、またはすぐに超音波処理に持ち越してここに保存することができます。 超音波ビオチン除去ステップ(130μL総サンプル量)からサンプルの複製を超音波処理用の130μL超音波処理器チューブにプールします。 表6に与えられたパラメータを使用してサンプルを超音波処理し、500bp未満のタイトな狭い分布を達成します。注:異なる超音波処理器タイプを使用することができますが、狭いフラグメント分布(100-500 bp)の場合、超音波処理器の設定は最適化が必要な場合があります。 磁気ビーズによるサイズ選択超音波処理管から超音波処理されたDNAを1.7mLの低結合チューブにピペットします。 各サンプルを1x TLEで総容量500 μLにします。サイズの選択にはサンプルと磁気ビーズの混合物の比率が不可欠であるため、容量をできるだけ500μLに近づけるようにしてください。 各チューブに400 μLの磁気ビーズ混合物を加えて、サンプル量に対する磁気ビーズ混合物の比率を0.8にします。注:これらの条件下では、ビーズはDNAフラグメント>300 bpを捕捉し、これが上部フラクションになります。上清には<300 bpの断片が含まれ、これが下部画分になります。 ボルテックスによってチューブを混合し、ローテーター上で室温で10分間インキュベートします。このサイズ選択比と他のサイズ選択比については、サンプルの全量がよく混ざることを確認してください。一部のローターにある「不安定モード」を探してください。 磁性粒子分離器(MPS)上で室温で5分間インキュベートします。 インキュベート中に、各サンプルの新しい1.7 μL低結合チューブに500 μLの磁気ビーズ混合物を追加します。注:これらのチューブは、1.1:1のサンプル比に対する磁気ビーズ混合物を生成することにより、下部フラクションの次のサイズ選択に使用されます。 チューブをMPSに5分間置いたままにします。 ビーズから上清を取り除き、150 μLの磁気ビーズ混合物で再懸濁します。注:この手順では、体積を増やさずにビーズの数を増やすことで、DNAによるビーズの飽和を回避します。 ステップ3.3.5の上清を準備された標識チューブに移し、下部画分を選択する(ステップ3.3.8)。注:150 μLの磁気ビーズ混合物+ 400 μLの0.8x磁気ビーズ混合物(合計550 μL)を初期サンプルの500 μLで割った値= 1.1x磁気ビーズ混合物とサンプルの比率。 下部フラクションチューブをボルテックスで混合し、ローテーター上で室温で10分間インキュベートします。注:ビーズはDNAフラグメント>100 bpに結合し、最終的なビーズ結合画分は100〜300 bpになります。 下部フラクションチューブをMPSに5分間(室温)置きます。 上清を取り除き、チューブを短時間遠心分離して、上清をさらに可能な限り除去します。 200 μLの70%エタノールを使用して両方のフラクションのビーズを2回洗浄し、毎回MPSで5分間ビーズを回収します。 遠心分離機ですばやく回転させた後、エタノールを完全に除去し、MPSでビーズをさらに乾燥させます。注意: アルコールが完全に蒸発するまで乾燥させます。ペレットは割れのないダークチョコレートのように見えるはずです(~10分かかる場合があります)。 両方のフラクションを50 μLの1x TLEバッファーに再懸濁します。室温で10分間インキュベートし、1分おきにチューブをタップまたはフリックして、混合と溶出を刺激します。 両方の画分について、MPSの上清からビーズを5分間分離します。 各サンプルの上清を保管してください。上清を1.7 mLの低結合チューブにピペットします。注:サンプルは、数日間4°Cまたは-20°Cで長期間保持できます。 表4のように2%アガロースゲルを実行し、サンプルの品質と量を決定します。このようなゲルの例については、図3を参照してください。注:経験から、超音波処理が非常に再現性が高い場合は、このゲルをスキップして、すぐに修復を終了することができます。滴定PCRが終わるまで、アッパーフラクションを保持することをお勧めします。多くのPCR増幅を必要とする最適ではないDNA量は、上部画分の材料から救うことができます。 既知のDNAラダー入力から標準曲線を生成した直後、または量子ビットまたはナノドロップを使用して、ゲルからのDNA量を定量します。 修理終了表7のようにエンドリペアミックスを調製する(反応当たりの量を与える)。 残りの46 μLの溶出DNAを下部フラクションからPCRチューブに移し、調製したエンドリペアミックス24 μLを加えます。 表7で提案されているように、PCRマシンでインキュベートします。 プログラムが完了したら、プルダウンするまでサンプルを4°Cに保ちます。 ストレプトアビジンコーティングビーズを用いたビオチン化ライゲーション産物のプルダウン(英語)定量されたサイズ選択から各ライブラリのストレプトアビジン被覆ビーズの量を決定します(ステップ3.3.19)。注:これらのストレプトアビジンコーティングビーズ(10 mg/mL溶液)は、mgビーズあたり20 μgの二本鎖DNAに結合できます(= 20 μg / 100 μLビーズ)。Hi-C DNA 1 μg ごとに 2 μL を使用しますが、10 μL 以上を使用します。 ストレプトアビジンでコーティングされたビーズを混合し、各ライブラリに必要なビーズの量(前のステップで計算)を個々の1.7 mL低結合チューブにピペットで入れます。 ビーズを400 μLのトゥイーン洗浄バッファー(TWB、 補足表S1のレシピを参照)に再懸濁し、ローテーター上で室温で~3分間インキュベートします(ステップ3.3.4の手順を参照)。 ビーズをMPSの上清から1分間分離し、上清を除去します。 さらに400 μLのTWBをピペッティングしてビーズを洗浄します。 ビーズをMPSの上清から1分間分離し、上清を除去します。 400 μLの2x結合バッファー(BB)( 補足表S1のレシピ)をビーズに加え、再懸濁します。さらに、330 μLの1x TLEとエンドリペアの溶液を追加します(ステップ3.4.3から)。 ローテーターで混合しながら、室温で15分間サンプルをインキュベートします。 ビーズをMPSの上清から1分間分離し、上清を除去します。 400 μLの1x BBをビーズに加え、再懸濁します。 ビーズをMPSの上清から1分間分離し、上清を除去します。 100 μLの1x TLEを加えてビーズを洗浄します。 ビーズをMPSの上清から1分間分離し、上清を除去します。 最後に、41 μLの1x TLEを加えてビーズを再懸濁します。 Aテーリング表8のようにAテーリングミックスを準備します。 反応物をPCRチューブにピペットし、 表8のようにインキュベートする。 サーモサイクラーから取り出した直後にPCRチューブを氷上に置き、内容物を1.7 mLの低結合チューブに移します。 ビーズをMPSの上清から1分間分離し、上清を廃棄します。 5x T4 DNAリガーゼバッファーから超純水で希釈した1xライゲーションバッファー400 μLを加えます。 ビーズをMPSの上清から1分間分離し、上清を廃棄します。 最終容量40 μLに1xライゲーションバッファーを追加します。 アニーリングアダプターオリゴ100 μMのアダプターオリゴストックを準備します(表9)。注:HPLC精製オリゴを250nmol注文します。 表9に記載のPCRチューブでアダプターをアニールします。 PCRサーモサイクラーを使用して、0.5°C/sの温度を97.5°Cまで徐々に上昇させます。 97.5°Cで2.5分間保持します。 PCRサーモサイクラーを使用して、0.1°C/sで775サイクル(20°Cに達する)で徐々に温度を上げます。さらに使用するまで、温度を4°Cに保持します。 83 μLの1xアニーリングバッファー( 補足表S1のレシピ)を加えて、アダプターを15 μMに希釈します。 アダプターは-20°Cで保管してください。 シーケンシングアダプターライゲーションアダプターライゲーションミックスを1.7 mLの低結合チューブで調製します(表10)。 室温で2時間リゲートします。 ビーズをMPSの上清から1分間分離し、上清を廃棄します。 400 μLのTWBを加え、ビーズを慎重に上下にピペッティングしてから、ローテーター上で室温で5分間インキュベートします。MPSの上清からビーズを分離し、この手順をもう一度繰り返します。 ビーズをMPSで上清から分離し(~1分)、上清を捨て、1x BBを200 μL加えます。 ビーズをMPS上の上清から分離し(~1分)、上清を廃棄します。 200 μLの1xプレPCRバッファー(10xから; 補足表S1のレシピ)を追加し、新しい1.7 mL低結合チューブに移します。 ビーズをMPS上の上清から分離し(~1分)、上清を廃棄します。 20 μLの1xプレPCRバッファーを加え、ピペッティングで混合します。 使用中はチューブを氷上に保管するか、4°Cで保管してください。 滴定によるPCRサイクル数の最適化表11のように、サンプルあたり30 μLのマスターミックス反応を設定します(反応あたりの量は所定の量)。 最小サイクル数を実行し、5 μLのアリコートを取ります。次の5 μLアリコートを服用する前に、残りの反応をさらに2〜3サイクル実行します。繰り返して4つのアリコートを収集します。 各アリコートについて 表11 のPCRパラメータを使用する。 各5 μLのサンプルに5 μLの水と2 μLの6x色素を加えます。2%アガロースTBEゲル( 補足表S1のレシピ)で25〜150 ngの低分子量ラダーで実行します。予想される結果については、 図 4 を参照してください。注:最終ライブラリPCR増幅に最適なサイクル数[ステップ3.10]は、ゲル上に目に見える生成物を得るための最小サイクル数から1サイクルを引いたものです。 最終ライブラリ PCR 増幅表11に示すように、12 x 30 μLの反応をセットアップして、シーケンシング用の各最終ライブラリを増幅します。 PCR滴定後のサイクル数を決定した後、 表11 に従ってPCR反応をサイクルする(ステップ3.9.3)。 PCRが完了したら、複製サンプルを1.7 mLの低結合マイクロフュージチューブにプールします。 チューブをMPSに置き、上清を新しい1.7 mL低結合マイクロフュージチューブに移します。 残りのストレプトアビジンコーティングビーズを20 μLの1xプレPCRバッファーに再懸濁します。注:このテンプレートは、4°Cで数日から数週間、または-20°Cで長期間保管した場合に再利用できます。 磁気ビーズ混合物によるプライマーの除去1x TLEバッファー( 補足表S1のレシピ)を使用して、ステップ3.10.4の容量を正確に360 μLに調整します。 各サンプルに、360 μLの磁気ビーズ混合物を加え、ピペットを上下に動かして混合します。 ローテーター上で、サンプルを室温で10分間混合します。 ビーズを室温(3〜5分)でMPSの上清から分離します。 200 μLの70%エタノールを使用してビーズを2回洗浄し、毎回MPSで5分間ビーズを回収します。 遠心分離機でクイックスピンし、エタノールを完全にピペットで除去します。ビーズをMPS上で空気中で乾燥させ、エタノールをさらに蒸発させます。注:ペレットは割れのないダークチョコレートのように見えるはずです(~10分かかる場合があります)。 30 μLの超純水を加えて再懸濁し、室温で10分間DNAを溶出します。混合を助けるために2分ごとにチューブをフリックします。 ビーズをMPSの上清から5分間分離します。 各サンプルから上清を新鮮な1.7 mLチューブに集めます。 1 μLのライブラリを2%アガロースTBE( 補足表S1のレシピ)ゲルで実行してフラグメントサイズ分布を取得し、最終的なライブラリを定量しました(図5)。注:ClaI消化はDpnII-DpnIIジャンクションでのみ発生し、最終的なライブラリのフラグメントサイズ分布を小さくするポジティブライゲーションコントロールとして機能します。最終ライブラリは、4°Cで数日間、-20°Cで長期間保存するか、すぐに希釈してシーケンシングに提出することができます。 表5:ビオチン除去試薬と温度 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 表6:超音波処理のためのパラメータ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 表7:エンドリペア試薬と温度。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 表8:Aテーリング試薬と温度。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 表9:PCRプライマーおよびアニーリング用の試薬アニーリングを含むペアエンドアダプターオリゴ。 略称:5PHOS = 5’リン酸。アスタリスクはホスホロチオ化DNA塩基を示す。 #インデックス付きオリゴとユニバーサルオリゴを組み合わせて、インデックス付きアダプターにアニールします。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 表10:アダプターライゲーション試薬。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 表11:PCR試薬とサイクリングパラメータ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 図3:典型的なサイズ選択後の結果を示すアガロースゲル。 DpnII-DdeI Hi-Cの4つのサンプル(番号1〜4)の上位分率と下部画分を示します。各サンプルの最初のレーンには、0.8倍の磁気ビーズ混合物に由来する上部フラクションが含まれ、2番目と3番目のレーンには、1.1倍の磁気ビーズ混合物に由来する下部フラクションの希釈が含まれています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:PCR滴定結果を含むアガロースゲル。 5サイクルのPCRから始めて、4つのライブラリのそれぞれについて2サイクル(5、7、9、および11サイクル)ごとにサンプルを採取します。この図に基づいて、各サンプルの最適サイクルとして6サイクルが選択されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図5:最終PCR産物。 洗浄およびサイズ選択の後、PCR産物(Hi-C)を、同じライブラリー(ClaI)のClaI消化画分の隣にロードした。ClaI消化フラグメントは、求められているDpnII-DpnIIライゲーションの存在を示す。ClaIはDpnII-DdeI接合を消化しないため、すべてのライゲーションがこの制限によるサイズ縮小に寄与するわけではないことに注意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。