Uzunluk Ölçekleri Arasında Kromozom Konformasyonunu Yakalama

1. Çapraz bağlama ile sabitleme Formaldehit fiksasyonu: tek katmanlı hücrelerden başlayarak150 mm plaka başına 5 × 106 hücre hasat etmek için uygun ortamda tohumlanmış hücrelere sahip olun.NOT: Kullanıcılar, herhangi bir memeli hücre hattının optimum büyümesini sağlayan tercih edilen herhangi bir kabı seçebilir. Ek olarak, hücreler dokudan izole edilebilir. Ortamı 150 mm plakadan bir vakum kapanına bağlı bir Pasteur pipetle aspire edin, ~ 10 mL HBSS ile 2x yıkayın. Çapraz bağlamadan hemen önce, 22.5 mL HBSS ve 625 μL% 37 FA’yı nihai% 1’lik bir konsantrasyona birleştirerek 50 mL’lik bir tüpte% 1’lik bir FA çapraz bağlama çözeltisi hazırlayın. Sallanarak hafifçe karıştırın.DİKKAT: Davlumbaz kullanın; formaldehit toksiktir. Hücreleri çapraz bağlamak için, her 15 cm’lik plakaya% 1 FA çözeltisinin 23.125 mL’sini dökün. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin ve plakaları her 2 dakikada bir elle hafifçe sallayın. 1,25 mL 2,5 M glisin (128 mM final) ekleyin ve çapraz bağlanma reaksiyonunu söndürmek için plakayı yavaşça döndürün. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin ve çapraz bağlantıyı durdurmak için en az 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübasyona devam edin. Hücreleri plakalardan bir hücre kazıyıcı veya lastik polisi ile kazıyın. Hücre süspansiyonunu bir pipet ile 50 mL’lik bir konik tüpe aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.000 × g’da santrifüj yapın ve süpernatantı aspirasyonla atın. Hücre peletini bir kez 10 mL Dulbecco’nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile yıkayın, yeniden askıya almak için bir pipet kullanın. Daha sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.000 × g’da santrifüj yapın. Hemen DSG çapraz bağlamaya geçin.NOT: Hücre peletini yıkarken dikkatli olun, çünkü hücre peletleri gevşeyebilir ve hücreler kaybolabilir. Formaldehit fiksasyonu: süspansiyondaki hücrelerden başlayarakDamar başına 5 × 106 hücre toplamak için uygun ortamda tohumlanmış hücrelere sahip olun.NOT: Kullanıcılar, herhangi bir memeli hücre hattının optimal hücre büyümesini sağlayan tercih edilen herhangi bir kabı seçebilir. Hasattan hemen önce, hücreleri sayın ve 5 × 106 hücreyi 50 mL’lik bir konik tüpe aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 × g’da santrifüj yaparak hücreleri nazikçe pelet edin. 45 mL HBSS’ye 1,25 mL% 37 FA ekleyerek % 1 FA çapraz bağlama çözeltisi hazırlayın ve tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın.NOT: Miktarı bölmeden 1,25 mL FA’nın tamamını ekleyin.DİKKAT: Formaldehit oldukça toksiktir. Hücre peletini, önceki adımda hazırlanan 46.25 mL’lik %1 FA çapraz bağlama çözeltisinde yukarı ve aşağı pipetle indirerek yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında rotatorda, rocker’da tam 10 dakika boyunca veya her 1-2 dakikada bir tüpün nazikçe manuel olarak ters çevrilmesiyle inkübe edin. 2,5 mL 2,5 M glisin (128 mM final) ekleyerek çapraz bağlanma reaksiyonunu söndürün ve tüpü ters çevirerek iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra çapraz bağlantıyı tamamen durdurmak için en az 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Çapraz bağlı hücreleri 10 dakika boyunca 1.000 × g’da peletlemek için oda sıcaklığında santrifüj yapın ve süpernatantı aspirasyonla atın. Hücreleri bir kez 10 mL DPBS ile yıkayın ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.000 × g’da santrifüj yapın. Bir pipet kullanarak süpernatantı tamamen atın ve hemen DSG çapraz bağlamaya geçin.NOT: Hücre peletini yıkarken dikkatli olun, çünkü hücre peletleri gevşeyebilir ve hücreler kaybolabilir. Dissüksinimidil glutarat ile çapraz bağlanmaPelet edilmiş hücreleri 9,9 mL DPBS’de 100 μL 300 mM DSG (3 mM final) eklemeden önce yeniden askıya alın. Ters çevirerek karıştırın.NOT: DSG neme duyarlıdır. Çapraz bağlama gününde DMSO’da 300 mM DSG’lik taze bir stok hazırlamak önemlidir.DİKKAT: DMSO’daki DSG oldukça toksiktir. Hücreleri oda sıcaklığında bir rotatorda 40 dakika boyunca çapraz bağlayın. 1,925 mL 2,5 M glisin (400 mM final) ekleyin, karıştırmak için ters çevirin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 2.000 × g’da santrifüj yapın.NOT: Süpernatantı gevşek hücre peletlerinden çıkarırken dikkatli olun. Peleti 1 mL% 0.05 sığır serum albümini (BSA)-DPBS içinde yeniden askıya alın ve 1.7 mL’lik bir tüpe aktarın.NOT: BSA ilavesi, hücre kümelenmesini azaltmaya yardımcı olabilir. Hücreleri 4 ° C’de 15 dakika boyunca 2.000 × g’da santrifüj edin ve süpernatantı pipetle çıkarın.NOT: Peletin kaybolmasını önlemek için, süpernatanı hızlı ve tamamen çıkarın. Peleti sıvı azot içinde çıtçıtlayın ve -80 ° C’de saklayın veya hemen bir sonraki adıma geçin. 2. Kromozom konformasyonu yakalama Hücre lizisi ve kromatin sindirimi10 μL proteaz inhibitörü kokteyli içeren 1 mL buz gibi soğuk lizis tamponunda (Ek Tablo S1’deki tarif) çapraz bağlı hücre alikotlarını (~5 × 106 hücre) yeniden askıya alın (pipet) ve buz üzerinde 15 dakikalık bir inkübasyon için bir sıçrama homojenizatörüne aktarın.NOT: Proteaz inhibitörlerini kullanımdan hemen önce lizis tamponuna ekleyin. Buz üzerindeki hücreleri homojenize etmek için havaneli A’yı yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirin ve hücrelerin soğumasını sağlamak için 1 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin, 30 vuruştan önce. Lisatı 1.7 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.NOT: Bazen hücreler pipet ucuna yapıştığı için süspansiyonu hareket halinde tutun. Lize süspansiyonu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2.500 × g’da santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve yeniden askıya almak için ıslak peleti hafifçe vurun veya vorteks yapın. Minimum kümelenme ile yoğurt benzeri bir madde elde etmek için süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. Peleti 500 μL buz gibi soğuk 1x Kısıtlama Tamponunda (10x’ten itibaren; Ek Tablo S1’deki tarife bakın) yeniden askıya alın ve 2.500 × g’da 5 dakika boyunca santrifüj yapın. İkinci bir yıkama için bu adımı tekrarlayın.NOT: 1x Kısıtlama Tamponundaki pelet, lizis tamponundaki önceki peletten daha granülerdir. Hücreleri, hücre boyutuna bağlı olarak peletin taşıma hacmine ~ 340 μL ekledikten sonra pipetle pipetleyerek 360 μL’lik son hacimde 1x Kısıtlama Arabelleğinde yeniden askıya alın. Kromatin Bütünlüğünü (CI) test etmek için her lizattan 18 μL’yi ayırın. CI örneklerini 4 °C’de saklayın. Her Hi-C tüpüne 38 μL% 1 sodyum dodesil sülfat (SDS) ekleyin (toplam hacim 380 μL) ve kabarcıklar sokmadan pipetleme yaparak dikkatlice karıştırın.DİKKAT: SDS zehirlidir. Kromatini açmak için numuneleri 65 ° C’de tam olarak 10 dakika boyunca sallamadan inkübe edin. Tüpleri hemen buz üzerine yerleştirin ve Tablo 1’de açıklandığı gibi SDS’yi söndürmek için Triton X-100 ile Sindirim Karışımını hazırlayın. Hi-C-tüpüne 107 μL Sindirim Karışımı ekleyin (toplam 487 μL) kromatini 37 °C’de gece boyunca (~16 saat) aralıklı çalkalanan bir termomikserde sindirmek için (örneğin, 900 rpm, 30 s açık, 4 dakika kapalı).NOT: Triton’un %1’lik nihai konsantrasyona eklenmesi, SDS’nin söndürülmesine hizmet eder. DNA uçlarının biyotinilasyonuGece boyunca sindirimden sonra, kalan endonükleaz aktivitesini devre dışı bırakmak için örnekleri 20 dakika boyunca 65 ° C’ye aktarın. Kuluçka sırasında, Tablo 2’de gösterildiği gibi bir doldurma ana karışımı hazırlayın. Kuluçkadan sonra, örnekleri hemen buzun üzerine yerleştirin. Her numune için 10 μL Sindirim Kontrolü (DC) ayırın ve 4 °C’de saklayın. Yoğuşmayı kapaktan pipetle veya eğirerek çıkarın. Her numuneye, 58 μL biyotin doldurma karışımı (toplam numune hacmi 535 μL) ekleyin ve kabarcık oluşturmadan yavaşça pipet ekleyin. Numuneleri bir termomikserde 4 saat boyunca 23 °C’de inkübe edin (örneğin, 900 rpm, 30 s açık, 4 dakika kapalı). Proksimal DNA fragmanlarının ligasyonuLigasyon karışımını Tablo 3’te gösterildiği gibi biyotin dolgusu inkübe edilirken hazırlayın. Her numuneye 665 μL ligasyon karışımı ekleyin (toplam numune hacmi 1.200 μL). Pipetleme yaparak nazikçe karıştırın. Numuneleri aralıklı sallanan bir termomikserde 4 saat boyunca 16 °C’de inkübe edin (örneğin, 900 rpm, 30 s açık, 4 dakika kapalı). Kovalent olarak bağlı kromatin içeren bu örnekleri birkaç gün boyunca 4 ° C’de saklayın. Çapraz bağlamanın tersine çevrilmesiCI ve DC numunelerinin hacimlerini 1x Tris Low EDTA ile 50 μL’ye getirin (TLE; Ek Tablo S1’deki tarife bakın). CI ve DC örneklerine 10 μL 10 mg / mL Proteinaz K ekleyin. Aralıklı sallama ile gece boyunca 65 ° C’de inkübe edin (örneğin, 900 rpm, 30 s açık, 4 dakika kapalı). Alternatif olarak, Hi-C örneklerinin DNA saflaştırılması sırasında bu kontroller için çapraz bağlamanın 30 dakikalık bir tersine çevrilmesini gerçekleştirin. Her Hi-C numunesine 50 μL 10 mg/mL Proteinaz K ekleyin ve aralıklı sallama ile en az 2 saat boyunca 65 °C’de inkübe edin (örneğin, 900 rpm, 30 s açık, 4 dakika kapalı). Her Hi-C tüpüne 50 μL 10 mg / mL Proteinaz K ekleyin (toplam numune hacmi 1.300 μL) ve gece boyunca 65 ° C’de inkübe etmeye devam edin. DNA saflaştırılana kadar 4 °C’de saklayın.NOT: Proteinaz K inkübasyonlarının bölünmesi, toplam protein sindirimini sağlar. DNA saflaştırmaTüplerin 65 °C’den oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Her numuneyi 15 mL’lik bir konik tüpe aktarın ve her tüpe 2,6 mL (2x hacim) fenol: kloroform: izoamil alkol ekleyin.DİKKAT: Fenol:kloroform:izoamil alkol çok toksik bir tahriş edicidir ve potansiyel olarak kanserojendir. Her tüpü 1 dakika boyunca vorteks yapın ve ardından içeriğini 15 mL’lik bir faz kilidi tüpüne aktarın. Numuneleri tezgah üstü bir santrifüjde maksimum hızda (1.500-3.500 × g) 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Sulu fazı dikkatlice 35 mL’lik bir ultrasantrifüj tüpüne dökün ve 1.250 μL’lik son hacme ultra saf su ekleyin.NOT: Mevcut ultrasantrifüje uyacak veya birden fazla mikrosantrifüj tüpüne bölünmüş tüpleri kullanın. 1/10’uncu hacim (~ 125 μL) 3 M sodyum asetat ekleyin ve ters çevirerek iyice karıştırın. Her numuneye 2,5x hacimli (~3,4 mL) buz soğuk% 100 etanol ekleyin, buz soğuk% 100 etanol ekleyerek ultrasantrifüjleme tüplerini dengeleyin ve ters çevirerek iyice karıştırın. Tüpleri kuru buz üzerinde ~ 15 dakika boyunca inkübe edin (katılaşmadan kaçının). Tüpleri 4 °C’de 30 dakika boyunca 18.000 × g’de santrifüj yapın.NOT: Açılı rotorlar için: Boruları peletin nerede olacağı konusunda işaretleyin. Bir pipet kullanarak, süpernatantı pelet olmayan taraftan tamamen çıkarın ve atın.NOT: Bu noktada, pelet görünür hale gelmeli ve tüp üzerinde işaretlenebilir, çünkü bir sonraki adımda kuruduktan sonra açıkça görülemeyebilir. Numuneleri yaklaşık 10 dakika boyunca veya gözle görülür şekilde kuruyana kadar hava ile kurutun. Her bir peleti pipetleme veya döndürme yoluyla 450 μL 1x TLE içinde çözündürün ve 3 kDa moleküler ağırlık kesme ile 0,5 mL Santrifüj Filtre Ünitesine (CFU) aktarın. CFU’yu 10 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj yapın ve akışı atın. Her ultrasantrifüj tüpünü ilave 450 μL 1x TLE ile yıkayın ve başka bir yıkama için CFU’suna aktarın.NOT: CFU’yu bu şekilde yıkamak, tuz konsantrasyonunu azaltırken DNA kaybını sınırlar. CFU’yu 10 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj yapın ve akışı atın. Sütuna 80 μL 1x TLE ekleyin ve ~ 100 μL’lik bir son hacim elde etmek için maksimum hızda 2 dakika santrifüj yapmadan önce sütunu yeni bir toplama tüpüne çevirin. Her numuneye 1 μL RnaseA (1 mg/mL; 10 mg/mL stokun 10 kat seyreltilmesi) ekleyin ve 37 °C’de bir ısı bloğunda, bir su banyosunda veya bir termomikserde en az 30 dakika inkübe edin. Rnase işleminden sonra, numuneleri 37 °C’den çıkarın ve kalite kontrol adımına kadar 4 °C’de saklayın. Kromatin kalitesini, enzim sindirimini ve numune ligasyonunu kontrol etmeAdım 2.4.5’teki çapraz bağlantıları tersine çevirdikten sonra CI ve DC numunelerini oda sıcaklığına soğutun. Ardından, önceden bükülmüş 2 mL faz kilidi tüpüne aktarın.NOT: Faz kilidi içeriğinin bir pelet üzerine santrifüj edildiğinden emin olun (2 dakika boyunca maksimum hız). 200 μL fenol: kloroform: izoamil alkol ekleyin ve örnekleri 1 dakika boyunca vorteks yaparak karıştırın. Tüpleri maksimum hızda 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Sulu fazı her numuneden (~ 50 μL) yeni bir 1.7 mL mikrofüj tüpüne aktarın. 1 μL Rnase A (1 mg / mL’den) ekleyin ve en az 30 dakika boyunca 37 ° C’de inkübe edin. Numuneleri Tablo 4’te önerildiği gibi% 0.8’lik bir agaroz jeli üzerine yükleyin.NOT: Bir kalite kontrolünden beklenen sonuçlar Şekil 2’de gösterilmiştir. DNA’yı jelden dansitometri ile veya Qubit veya Nanodrop kullanarak sayısallaştırın.NOT: Doğru niceleme, protokolün bir sonraki bölümünde doğru giriş hacmini sağlar. Standart bir eğri oluşturmak için bilinen bir miktara sahip birkaç standart kullanın. Tablo 1: Sindirim reaktifleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Tablo 2: Biotin dolgu reaktifleri. * Enzimlerin değiştirilmesinin farklı tamponlar ve biyotinile dNTP’ler gerektirebileceğini unutmayın. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Tablo 3: Ligasyon karışımı reaktifleri. Kısaltma: BSA = sığır serum albümini. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Tablo 4: Kalite ve boyut seçimi değerlendirmesi için jel yükleme parametreleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil 2: Tipik postDNA saflaştırma kalite kontrol sonuçlarını gösteren agaroz jeli . (A) CI kontrolü, yüksek moleküler ağırlıklı DNA’nın bir bandını göstermelidir. (B) DC ve Hi-C örnekleri bir dizi DNA boyutu gösterir. Daha büyük parçalar halinde birleştirilen Hi-C örneği, DC’den daha yüksek moleküler ağırlığa sahip olmalıdır. İşaretçilerin konsantrasyon aralığı, standart bir eğri oluşturulmasına izin verir. Bu örnekte, CI’nin ayrı bir jel üzerine yüklendiğini, ancak tüm numunelerin ve kontrollerin birlikte yüklenmesi ve çalıştırılması önerilir. Kısaltmalar: CI = kromatin bütünlüğü; DC = sindirim kontrolü; Hi-C = yakınlık bağlı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 3. Hi-C sıralama kütüphanesi hazırlama Bitotinin bağlanmamış uçlardan uzaklaştırılmasıTablo 5’te gösterildiği gibi biyotin giderme reaksiyonları hazırlayın.NOT: Tipik olarak, 10 μg DNA yeterlidir, ancak 30 μg’a kadar kullanılabilir. Her 130 μL reaksiyondan 2 x 65 μL alikotu iki PCR tüpüne dağıtın. Bir termosikler veya PCR makinesine aktarın ve Tablo 5’te açıklandığı gibi inkübe edin.NOT: Örnekler burada 4 ° C’de (günlerden haftalara), -20 ° C’de (uzun vadeli) saklanabilir veya hemen sonikasyona aktarılabilir. SonicationNumune, biyotin kaldırma adımından (130 μL toplam numune hacmi) sonikasyon için 130 μL sonikatör tüpüne kopyalanır. 500 bp’nin altında sıkı bir dar dağılım elde etmek için Tablo 6’da verilen parametreleri kullanarak örnekleri sonikleştirin.NOT: Farklı sonicator türleri kullanılabilir, ancak dar bir parça dağılımı (100-500 bp) için sonicator ayarları optimizasyon gerektirebilir. Manyetik boncuklarla boyut seçimiSonik DNA’yı sonikatör tüplerinden 1.7 mL’lik düşük bağlayıcı bir tüpe pipet yapın. Her numuneyi 1x THE ile toplam 500 μL hacme getirin. Hacmi mümkün olduğunca 500 μL’ye yaklaştırmaya çalışın, çünkü numunenin manyetik boncuk karışımına oranı boyut seçimi için gereklidir. Manyetik boncuk karışımının 0.8’lik numune hacmine oranını elde etmek için her tüpe 400 μL manyetik boncuk karışımı ekleyin.NOT: Bu koşullar altında, boncuklar Üst Fraksiyon olacak >300 bp DNA fragmanlarını yakalar. Süpernatant, Alt Fraksiyon olacak <300 bp parçaları içerecektir. Tüpleri vorteks ile karıştırın ve bir döndürücü üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Bu ve diğer boyut seçim oranları için, numunenin tam hacminin iyi karıştığından emin olun. Bazı rotorların sahip olduğu ve daha küçük hacimler için iyi çalışan “düzensiz modu” arayın. Manyetik parçacık ayırıcı (MPS) üzerinde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçka sırasında, her numune için taze 1.7 μL düşük bağlayıcı tüpe 500 μL manyetik boncuk karışımı ekleyin.NOT: Bu tüpler, 1.1: 1’lik numune oranına manyetik boncuk karışımı oluşturarak alt fraksiyonun bir sonraki boyut seçimi için kullanılacaktır. Tüpleri MPS üzerinde 5 dakika bekletin. Süpernatantı boncuklardan çıkarın ve manyetik boncuk karışımının 150 μL’si ile yeniden askıya alın.NOT: Bu adım, hacmi arttırmadan boncuk sayısını artırarak boncukların DNA ile doygunluğunu önler. Süpernatantı adım 3.3.5’ten Alt Fraksiyonu seçmek için hazırlanan etiketli tüpe aktarın (adım 3.3.8).NOT: 150 μL manyetik boncuk karışımı + 400 μL 0,8x manyetik boncuk karışımı (toplam 550 μL), 500 μL başlangıç numunesine bölünür = 1,1x manyetik boncuk karışımı numune oranına. Alt Fraksiyon tüplerini vorteks ile karıştırın ve bir rotatorda oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.NOT: Boncuklar, DNA parçalarını 100 bp’> bağlayacak ve 100-300 bp’lik son bir boncuk bağlı fraksiyonla sonuçlanacaktır. Alt Fraksiyonlu tüpleri MPS’ye 5 dakika (oda sıcaklığında) koyun. Süpernatantı çıkarın ve süpernatantı mümkün olduğunca daha fazla çıkarmak için tüpleri kısaca santrifüj yapın. Her iki fraksiyondaki boncukları 200 μL etanol kullanarak iki kez yıkayın ve boncukları her seferinde MPS’de 5 dakika boyunca geri kazanın. Bir santrifüjde hızlı bir şekilde döndürüldükten sonra, etanol tamamen çıkarın ve MPS üzerindeki boncukları daha da kurutun.NOT: Alkol tamamen buharlaşana kadar kurutun. Pelet çatlamadan koyu çikolata gibi görünmelidir (~ 10 dakika sürebilir). Her iki fraksiyonu da 50 μL 1x TLE arabelleğinde yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin ve karıştırma ve elüsyonu teşvik etmek için tüplere her iki dakikada bir dokunun veya hafifçe vurun. Boncukları, her iki fraksiyon için de 5 dakika boyunca MPS üzerindeki süpernatanttan ayırın. Süpernatantı her numuneden saklayın. Süpernatantı 1.7 mL’lik düşük bağlayıcı bir tüpe pipetin.NOT: Numuneler birkaç gün boyunca 4 °C’de veya uzun süre -20 °C’de tutulabilir. Numune kalitesini ve miktarını belirlemek için Tablo 4’te olduğu gibi% 2’lik bir agaroz jeli çalıştırın. Böyle bir jel örneği için Şekil 3’e bakınız.NOT: Deneyimden, sonikasyon yüksek oranda tekrarlanabilirse, biri bu jeli atlayabilir ve derhal onarımı sona erdirmeye devam edebilir. Kullanıcıların titrasyon PCR’sinden sonraya kadar Üst Fraksiyonları tutmaları önerilir. Çok fazla PCR amplifikasyonu gerektiren yetersiz DNA miktarları, Üst Fraksiyondaki materyalden kurtarılabilir. Bilinen DNA merdiven girişinden standart bir eğri oluşturduktan sonra veya bir Qubit veya Nanodrop kullanarak jelden DNA miktarını doğrudan ölçün. Son onarımSon onarım karışımını Tablo 7’deki gibi hazırlayın (verilen reaksiyon başına miktar). Kalan 46 μL salınımlı DNA’yı Alt Fraksiyondan PCR tüplerine aktarın ve hazırlanan son onarım karışımının 24 μL’sini ekleyin. Tablo 7’de önerildiği gibi bir PCR makinesinde inkübe edin. Program tamamlandıktan sonra, numuneleri aşağı çekilene kadar 4 ° C’de tutun. Streptavidin kaplı boncuklu biyotinillenmiş ligasyon ürünlerinin aşağı çekilmesiNiceliklendirilmiş boyut seçiminden her kütüphane için streptavidin kaplı boncuk miktarını belirleyin (adım 3.3.19).NOT: Bu streptavidin kaplı boncuklar (10 mg / mL çözeltisi), mg boncuklar başına 20 μg çift sarmallı DNA’yı bağlayabilir (= 20 μg / 100 μL boncuklar). Her 1 μg Hi-C DNA için 2 μL kullanın, ancak 10 μL’den az kullanmayın. Streptavidin kaplı boncukları karıştırın ve her kütüphane için gereken boncuk hacmini (önceki adımda hesaplanan) ayrı ayrı 1,7 mL düşük bağlama tüplerine pipetleyin. Boncukları 400 μL Ara yıkama tamponunda (TWB; Ek Tablo S1’deki tarife bakın) yeniden askıya alın ve bir rotatörde oda sıcaklığında ~ 3 dakika kuluçkaya yatın (adım 3.3.4’teki talimatlara bakın). Boncukları MPS üzerindeki süpernatanttan 1 dakika boyunca ayırın ve süpernatanı çıkarın. Boncukları başka bir 400 μL TWB pipetleyerek yıkayın. Boncukları MPS üzerindeki süpernatanttan 1 dakika boyunca ayırın ve süpernatanı çıkarın. Boncuklara 400 μL 2x Bağlayıcı Arabellek (BB) ( Ek Tablo S1’deki tarif) ekleyin ve tekrar askıya alın. Ek olarak, 330 μL 1x TLE ve çözümü Son onarımdan (adım 3.4.3’ten) ekleyin. Bir rotatorda karıştırırken numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Boncukları MPS üzerindeki süpernatanttan 1 dakika boyunca ayırın ve süpernatanı çıkarın. Boncuklara 400 μL 1x BB ekleyin ve tekrar askıya alın. Boncukları MPS üzerindeki süpernatanttan 1 dakika boyunca ayırın ve süpernatanı çıkarın. Boncukları yıkamak için 100 μL 1x TLE ekleyin. Boncukları MPS üzerindeki süpernatanttan 1 dakika boyunca ayırın ve süpernatanı çıkarın. Son olarak, boncukları yeniden askıya almak için 41 μL 1x TLE ekleyin. A-kuyruklamaA-tailing karışımını Tablo 8’deki gibi hazırlayın. Reaksiyonları PCR tüplerine pipetleyin ve Tablo 8’deki gibi inkübe edin. PCR tüplerini termosiklerden çıkarıldıktan hemen sonra buzun üzerine yerleştirin ve içeriği 1.7 mL düşük bağlayıcı tüplere aktarın. Boncukları MPS üzerindeki süpernatanttan 1 dakika ayırın ve süpernatanı atın. Ultra saf su ile 5x T4 DNA ligaz tamponundan seyreltilmiş 400 μL 1x ligasyon tamponu ekleyin. Boncukları MPS üzerindeki süpernatanttan 1 dakika boyunca ayırın ve ardından süpernatanı atın. 40 μL’lik son hacme 1x ligasyon tamponu ekleyin. Tavlama adaptörü oligoları100 μM’lik adaptör oligo stokları hazırlayın (Tablo 9).NOT: HPLC saflaştırılmış oligoların 250 nmolünü sipariş edin. Adaptörleri PCR tüplerinde Tablo 9’da açıklandığı gibi tavlayın. Sıcaklığı 0,5 ° C / s’de kademeli olarak 97,5 ° C’ye yükseltmek için bir PCR termosikler kullanın. 97,5 °C’de 2,5 dakika bekletin. 775 döngü (20 ° C’ye ulaşan) için sıcaklığı 0,1 ° C / s’de kademeli olarak yükseltmek için bir PCR termosikler kullanın. Daha fazla kullanana kadar sıcaklığı 4 ° C’de tutun. Adaptörleri 15 μM’ye seyreltmek için 83 μL 1x Tavlama Arabelleği (Ek Tablo S1’deki tarif) ekleyin. Sıralama adaptörü ligasyonuAdaptör ligasyon karışımını 1,7 mL’lik düşük bağlayıcı bir tüpte hazırlayın (Tablo 10). Oda sıcaklığında 2 saat boyunca bağlayın. Boncukları MPS üzerindeki süpernatanttan 1 dakika ayırın ve süpernatanı atın. 400 μL TWB ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca rotatörde inkübasyondan önce boncukları dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin. Boncukları MPS üzerindeki süpernatanttan ayırın ve bu adımı bir kez daha tekrarlayın. Boncukları MPS üzerindeki süpernatanttan ayırın (~1 dakika), süpernatanı atın ve 200 μL 1x BB ekleyin. Boncukları MPS üzerindeki süpernatanttan ayırın (~1 dk) ve süpernatanı atın. 200 μL 1x PCR öncesi Tampon ekleyin (10x’ten; Ek Tablo S1’deki tarif) ve yeni bir 1,7 mL düşük bağlayıcı tüpe aktarın. Boncukları MPS üzerindeki süpernatanttan ayırın (~1 dk) ve süpernatanı atın. 20 μL 1x PCR öncesi Arabellek ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Tüpleri kullanım sırasında buz üzerinde tutun veya 4 ° C’de saklayın. Titrasyonla PCR çevrim numarasının optimizasyonuTablo 11’de olduğu gibi numune başına 30 μL ana karışım reaksiyonu ayarlayın (verilen reaksiyon başına miktar). En düşük döngü sayısını çalıştırın ve 5 μL aliquot alın. Bir sonraki 5 μL aliquot’u almadan önce kalan reaksiyon üzerinde ek 2-3 döngü çalıştırın. Dört aliquot toplamak için tekrarlayın. Her aliquot için Tablo 11’deki PCR parametrelerini kullanın. Her 5 μL numuneye 5 μL su ve 2 μL 6x boya ekleyin. 25-150 ng Düşük Moleküler ağırlıklı merdiven ile% 2’lik bir agaroz TBE jeli ( Ek Tablo S1’deki tarif) üzerinde çalıştırın. Beklenen sonuçlar için Şekil 4’e bakın.NOT: Son kütüphane PCR amplifikasyonu için en uygun döngü sayısı [adım 3.10], jel eksi bir döngü üzerinde görünür ürün elde etmek için en düşük döngü sayısıdır. Son kütüphane PCR amplifikasyonuTablo 11’de olduğu gibi sıralama için her bir son kitaplığı yükseltmek üzere 12 x 30 μL reaksiyonları ayarlayın. PCR titrasyonundan sonraki döngü sayısını belirledikten sonra PCR reaksiyonlarını Tablo 11’e göre çevrimlendirin (adım 3.9.3). PCR tamamlandıktan sonra, çoğaltılan numuneleri 1.7 mL’lik düşük bağlayıcı bir mikrofüj tüpünde toplayın. Tüpleri MPS’ye yerleştirin ve süpernatantı yeni bir 1,7 mL düşük bağlayıcı mikrofüj tüpüne aktarın. Artık streptavidin kaplı boncukları 20 μL 1x PCR öncesi Arabellekte yeniden askıya alın.NOT: Bu şablon, 4 °C’de günlerce haftalarca veya -20 °C’de uzun süreli olarak saklandığında yeniden kullanılabilir. Astarların manyetik boncuk karışımı ile çıkarılmasıSes seviyesini adım 3.10.4’ten tam olarak 360 μL’ye ayarlamak için 1x TLE arabelleği ( Ek Tablo S1’deki tarif) kullanın. Her numuneye, karıştırmak için 360 μL manyetik boncuk karışımı ve pipeti yukarı ve aşağı ekleyin. Bir rotatorda, numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika karıştırın. Boncukları, oda sıcaklığında (3-5 dakika) MPS üzerindeki süpernatanttan ayırın. Boncukları 200 μL etanol kullanarak iki kez yıkayın ve boncukları her seferinde MPS’de 5 dakika boyunca geri kazanın. Bir santrifüjde hızlı döndürün ve etanolden tamamen pipet çekin. Etanolün daha da buharlaştırılması için boncukları MPS üzerinde havada kurutun.NOT: Pelet çatlamadan bitter çikolata gibi görünmelidir (~ 10 dakika sürebilir). 30 μL ultra saf su ekleyin ve DNA’yı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca süzmek için yeniden askıya alın. Karıştırmaya yardımcı olmak için tüpleri her 2 dakikada bir hafifçe kaydırın. Boncukları MPS üzerindeki süpernatanttan 5 dakika boyunca ayırın. Her numuneden süpernatantı taze bir 1,7 mL tüpte toplayın. Bir parça boyutu dağılımı elde etmek ve son kütüphaneyi ölçmek için kütüphanenin 1 μL’sini %2’lik bir agaroz TBE ( Ek Tablo S1’deki tarif) jeli üzerinde çalıştırın (Şekil 5).NOT: ClaI sindirimi yalnızca DpnII-DpnII kavşakları için gerçekleşebilir ve son kütüphane için daha düşük bir parça boyutu dağılımı ile sonuçlanması gereken pozitif bir ligasyon kontrolü görevi görür. Son kütüphaneler 4 °C’de birkaç gün, -20 °C’de uzun süreli saklanabilir veya hemen seyreltilip sıralama için gönderilebilir. Tablo 5: Biotin giderim reaktifleri ve sıcaklıkları Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Tablo 6: Sonikasyon için parametreler. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Tablo 7: Son onarım reaktifleri ve sıcaklıkları. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Tablo 8: A-tailing reaktifleri ve sıcaklıkları. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Tablo 9: PCR Primer’lar ve Çift-Uç-adaptör oligoları, tavlama için reaktif tavlamalı. Kısaltma: 5PHOS = 5′ fosfat. Yıldız işaretleri fosforothioated DNA bazlarını gösterir. # Dizinlenmiş bir oligoyu, dizinlenmiş bir adaptöre tavlamak için Evrensel oligo ile birleştirin. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Tablo 10: Adaptör ligasyon reaktifleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Tablo 11: PCR reaktifleri ve döngü parametreleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Şekil 3: Tipik boyut sonrası seçim sonuçlarını gösteren agarose jeli. DpnII-DdeI Hi-C’nin dört örneği (1-4 numaralı) için Üst ve Alt Fraksiyonlar gösterilmiştir. Her numune için ilk şerit, 0.8x manyetik boncuk karışımından türetilen Üst fraksiyonu içerir ve ikinci ve üçüncü şeritler, 1.1x manyetik boncuk karışımından türetilen Alt Fraksiyonun seyreltilmesini içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Resim 4: PCR titrasyon sonuçları olan agaroz jeli. 5 döngü PCR’den başlayarak, dört kütüphanenin her biri için her 2 döngüden (5, 7, 9 ve 11 döngü) sonra örnekler alınır. Bu şekle dayanarak, her numune için en uygun döngü olarak 6 döngü seçildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Son PCR ürünleri. Temizlik ve boyut seçiminden sonra, PCR ürünleri (Hi-C), aynı kütüphanenin (ClaI) ClaI sindirilmiş bir fraksiyonunun yanına yüklendi. ClaI sindirilmiş fragmanlar, aranan DpnII-DpnII ligasyonlarının varlığını gösterir. ClaI’nin DpnII-DdeI kavşaklarını sindirmediğini ve bu nedenle tüm ligasyonların bu kısıtlamadan kaynaklanan boyut küçülmesine katkıda bulunmayacağını unutmayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.