В пробирке Анализ уничтожения эритроцитов, инфицированных плазмодием, цитотоксическими лимфоцитами

Малярия остается глобальным кризисом в области здравоохранения: в 2020 г. было зарегистрировано более 240 миллионов случаев заболевания малярией и 627 000 случаев смерти, связанных с малярией¹. В настоящее время существует пять паразитических видов, которые могут вызывать малярию у людей, из которых Plasmodium falciparum и Plasmodium vivax являются двумя наиболее распространенными видами. Во время инфекции Plasmodium печень или преэритроцитарная стадия протекает бессимптомно, и симптомы возникают только во время бесполого цикла паразита на эритроцитарной стадии. На этой стадии инфекции тысячи мерозоитов, полученных из печени, высвобождаются в кровоток и заражают эритроциты (эритроциты). В эритроцитах паразиты дифференцируются на трофозоиты и шизонты путем шизогонии, пока шизонты не разорвут эритроцит, высвобождая новообразованные мерозоиты, повторяя этот круговорот крови. Повторяющиеся циклы инвазии, репликации и высвобождения мерозоита приводят к экспоненциальному росту популяции паразитов и, в конечном итоге, вызывают симптомы заболевания².

Важной проблемой в изучении иммунного ответа на малярию является то, что Plasmodium spp. То, что заражает людей, не заражает модели лабораторных животных. Таким образом, образцы пациентов, инфицированных плазмодием, должны быть собраны свежими и немедленно обработаны и проанализированы. Однако в эндемичных по малярии районах ресурсы для доступа к иммунологическим и молекулярным механизмам ограничены. Из-за этих ограничений грызуны широко используются в качестве экспериментальных моделей для исследования иммунного ответа против инфекции Plasmodium. В то время как P. berghei и P. chabaudi часто используются в качестве суррогатов инфекции P. falciparum, нелетальный штамм P. yoelii 17XNL также имеет много общих черт с P. vivax, таких как инфекция с ограничением ретикулоцитов ^3,4. Разработка анализов Plasmodium in vitro, которые могут быть использованы для образцов, полученных на моделях человека или животных, ценна для лучшего понимания патогенеза малярии и сравнения иммунологического ответа, вызванного различными видами паразита.

Защитный противомалярийный иммунитет до конца не изучен ни на предэритроцитарной стадии, ни на стадии крови. Известно, что воздействие повторных инфекций приводит к частичному приобретению иммунитета, но стерильный иммунитет вырабатывается^редко5. В течение десятилетий антиплазмодиев протективный иммунитет был в основном связан с индукцией нейтрализующих или опсонизирующих антител, которые предотвращают вторжение паразитов в клетки-хозяева или приводят к фагоцитозу антигенпрезентирующими клетками, соответственно⁶. В результате большинство усилий по производству противомалярийных вакцин до сих пор основывалось на индуцировании защитных и длительных антител ^7,8. Однако стерильная защита, индуцированная вакцинацией аттенуированным спорозоитом, напрямую коррелирует с активацией и экспансией цитотоксических Т-лимфоцитов ^8,9.

Недавно некоторые исследования свежевыделенных образцов пациентов и культур in vitro показали, что врожденные или адаптивные цитотоксические иммунные клетки, такие как CD8 ⁺ T¹⁰, γδ T 11 и NK-клетки¹², могут напрямую уничтожать инфицированные плазмодием эритроциты и его внутриклеточного паразита в соотношении эффектор: цель. Эти основополагающие результаты определили совершенно новый иммунный эффекторный механизм в контексте малярии. Чтобы проанализировать этот новый противомалярийный иммунитет, важно изучить цитотоксические эффекторные механизмы клеток-киллеров против инфицированных эритроцитов (iRBC) при естественной инфекции или вакцинации.

Здесь мы представляем анализ in vitro , который измеряет цитотоксическую активность лимфоцитов против малярии на стадии крови. Этот анализ может помочь выяснить механизмы клеточного иммунного ответа против стадии эритроцитов Plasmodium . Клетки-мишени, iRBCs, помечаются сукцинимидиловым эфиром карбоксифлуоресцеина (CFSE) для оценки жизнеспособности клеток, а затем культивируются совместно с эффекторными клетками, такими как цитотоксические лимфоциты (CTL). Затем эта кокультура оценивается с помощью проточной цитометрии с использованием флуоресцентных маркеров для определенных типов клеток. Наконец, процент лизиса iRBC с помощью CTL рассчитывается путем деления экспериментального условия на спонтанный разрыв эритроцитов и контроль спонтанного лизиса, который происходит во время инкубации без эффекторной клетки. В целом, эта методология анализа убийства может способствовать лучшему пониманию клеточно-опосредованного иммунитета к малярии.