In vitro Bepaling van plasmodium-geïnfecteerde rode bloedceldoding door cytotoxische lymfocyten

Malaria blijft een wereldwijde gezondheidscrisis, met meer dan 240 miljoen gevallen en 627.000 malariagerelateerde sterfgevallen gemeld in 2020¹. Er zijn momenteel vijf parasitaire soorten die malaria bij de mens kunnen veroorzaken, waarvan Plasmodium falciparum en Plasmodium vivax de twee meest voorkomende soorten zijn. Tijdens Plasmodium-infectie is de lever of het pre-erytrocytische stadium asymptomatisch en treden de symptomen alleen op tijdens de aseksuele cyclus van de parasiet in het erytrocytische stadium. In dit infectiestadium worden duizenden merozoïeten afgeleid van het leverstadium vrijgegeven in de bloedbaan en infecteren rode bloedcellen (RBC’s). In de RBC differentiëren de parasieten in trofozoïeten en schizonten door schizogonie, totdat schizonten de erytrocyt scheuren, nieuw gevormde merozoieten vrijgeven en deze bloedcyclus herhalen. Herhaalde cycli van invasie, replicatie en merozoïetafgifte resulteren in een exponentiële groei van de parasietpopulatie en veroorzaken uiteindelijk ziektesymptomen².

Een belangrijke uitdaging bij het bestuderen van de immuunrespons op malaria is dat de Plasmodium spp. die mensen infecteert, infecteert geen proefdiermodellen. Plasmodium-geïnfecteerde patiëntmonsters moeten dus vers worden verzameld en onmiddellijk worden verwerkt en geanalyseerd. In malaria-endemische gebieden zijn de middelen om toegang te krijgen tot immunologische en moleculaire mechanismen echter beperkt. Vanwege deze beperkingen worden knaagdieren veel gebruikt als experimentele modellen om de immuunrespons tegen Plasmodium-infectie te onderzoeken. Hoewel P. berghei en P. chabaudi vaak worden gebruikt als surrogaten voor P. falciparum-infectie, heeft de niet-dodelijke stam van P. yoelii 17XNL ook veel kenmerken gemeen met P. vivax, zoals reticulocytenbeperkte infectie ^3,4. De ontwikkeling van Plasmodium in vitro assays, die kunnen worden gebruikt voor van menselijke of dierlijke modellen afgeleide monsters, is waardevol voor het verkrijgen van een beter begrip van de pathogenese van malaria en het vergelijken van de immunologische respons die wordt opgewekt door verschillende soorten van de parasiet.

Beschermende antimalaria-immuniteit wordt niet volledig begrepen, noch in het pre-erytrocytische stadium, noch in het bloedstadium. Het is bekend dat blootstelling aan herhaalde infecties resulteert in gedeeltelijk verworven immuniteit, maar steriele immuniteit wordt zelden ontwikkeld⁵. Decennialang werd anti-Plasmodium beschermende immuniteit voornamelijk geassocieerd met de inductie van neutraliserende of opsoniserende antilichamen die parasitaire invasie van gastheercellen voorkomen of leiden tot fagocytose door antigeen-presenterende cellen, respectievelijk⁶. Als gevolg hiervan zijn de meeste inspanningen om antimalariavaccins te produceren tot nu toe gebaseerd op het induceren van beschermende en langdurige antilichamen ^7,8. De steriele bescherming geïnduceerd door vaccinatie met een verzwakt sporozoiet correleert echter direct met de activering en expansie van cytotoxische T-lymfocyten ^8,9.

Onlangs hebben sommige studies van vers geïsoleerde patiëntmonsters en in vitro culturen aangetoond dat aangeboren of adaptieve cytotoxische immuuncellen zoals CD8 ⁺ T 10, γδ T¹¹ en NK-cellen¹² plasmodium-geïnfecteerde RBC’s en zijn intracellulaire parasiet direct kunnen elimineren op een effector: target ratio manier. Deze baanbrekende bevindingen definieerden een geheel nieuw immuuneffectormechanisme in de context van malaria. Om deze nieuwe antimalaria-immuniteit te ontleden, is het essentieel om cytotoxische effectormechanismen van killercellen tegen geïnfecteerde RBC’s (iRBC’s) bij natuurlijke infectie of vaccinatie te onderzoeken.

Hier presenteren we een in vitro test die de cytotoxische activiteit van lymfocyten tegen malaria in het bloedstadium meet. Deze test kan vervolgens helpen bij het ophelderen van de mechanismen van de cellulaire immuunrespons tegen het Plasmodium erytrocytenstadium. De doelcellen, iRBC’s, worden gelabeld met carboxyfluoresceïnesuccinimidylester (CFSE) om de levensvatbaarheid van cellen te evalueren en worden vervolgens gecocultiveerd met effectorcellen zoals cytotoxische lymfocyten (CTL). Deze cocultuur wordt vervolgens geëvalueerd door flowcytometrie, met behulp van fluorescerende markers voor specifieke celtypen. Ten slotte wordt het percentage iRBC-lysis door CTL berekend door de experimentele toestand te delen door de spontane breuk van RBC’s en spontane lysiscontrole, die optreedt tijdens incubatie zonder de effectorcel. Over het algemeen kan deze dodingstestmethode bijdragen aan een beter begrip van celgemedieerde malaria-immuniteit.