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Neuroscience

Entrega intracerebroventricular de metabolitos microbianos derivados del intestino en ratones que se mueven libremente

Published: June 02, 2022
doi:
10.3791/63972
, ,
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine,National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine,National Cheng Kung University

Summary

Los metabolitos microbianos derivados del intestino tienen efectos multifacéticos que conducen a un comportamiento complejo en los animales. Nuestro objetivo es proporcionar un método paso a paso para delinear los efectos de los metabolitos microbianos derivados del intestino en el cerebro a través de la administración intracerebroventricular a través de una cánula guía.

Abstract

El impacto de la microbiota intestinal y sus metabolitos en la fisiología y el comportamiento del huésped ha sido ampliamente investigado en esta década. Numerosos estudios han revelado que los metabolitos derivados de la microbiota intestinal modulan las funciones fisiológicas mediadas por el cerebro a través de intrincadas vías intestino-cerebro en el huésped. Los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) son los principales metabolitos derivados de bacterias producidos durante la fermentación de la fibra dietética por el microbioma intestinal. Los AGCC secretados desde el intestino pueden actuar en múltiples sitios en la periferia, afectando las respuestas inmunes, endocrinas y neuronales debido a la vasta distribución de los receptores de AGCC. Por lo tanto, es difícil diferenciar los efectos centrales y periféricos de los AGCC a través de la administración oral e intraperitoneal de AGCC. Este documento presenta un método basado en video para interrogar el papel funcional de los AGCC en el cerebro a través de una cánula guía en ratones que se mueven libremente. La cantidad y el tipo de AGCC en el cerebro se pueden ajustar controlando el volumen y la velocidad de infusión. Este método puede proporcionar a los científicos una forma de apreciar el papel de los metabolitos derivados del intestino en el cerebro.

Introduction

El tracto gastrointestinal humano alberga diversos microorganismos que impactan al huésped 1,2,3. Estas bacterias intestinales pueden secretar metabolitos derivados del intestino durante la utilización de los componentes dietéticos consumidos por el huésped 4,5. Curiosamente, los metabolitos intestinales no metabolizados en la periferia pueden ser transportados a otros órganos a través de la circulación6. Cabe destacar que estos metabolitos secretados pueden servir como mediadores para el eje intestino-cerebro, definido como la comunicación bidireccional entre el sistema nervioso central y el intestino7. Estudios previos han demostrado que los metabolitos derivados del intestino pueden modular el comportamiento complejo y la emoción en animales 8,9,10,11.

Los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) son los principales metabolitos producidos por la microbiota intestinal durante la fermentación de la fibra dietética y los carbohidratos no digeribles6. El acetato, el propionato y el butirato son los AGCC más abundantes en el intestino12. Los AGCC sirven como fuente de energía para las células en el tracto gastrointestinal. Los AGCC no metabolizados en el intestino pueden ser transportados al cerebro a través de la vena porta, modulando así el cerebro y el comportamiento 6,12. Estudios previos han sugerido que los AGCC podrían desempeñar un papel crítico en los trastornos neuropsiquiátricos 6,12. Por ejemplo, la inyección intraperitoneal de butirato en ratones BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR), un modelo animal de trastorno del espectro autista (TEA), rescató sus déficits sociales13. Las ratas tratadas con antibióticos que recibieron microbiota de sujetos depresivos mostraron un aumento en los comportamientos similares a la ansiedad y los AGCC fecales14. Clínicamente, se observaron alteraciones en los niveles de AGCC fecales en personas con TEA en comparación con los controles de desarrollo típico15,16. Las personas con depresión tienen niveles más bajos de AGCC fecales que los sujetos sanos17,18. Estos estudios sugirieron que los AGCC pueden alterar el comportamiento en animales y humanos a través de varias rutas.

Los metabolitos microbianos ejercen diversos efectos en múltiples sitios del cuerpo, afectando la fisiología y los comportamientos del huésped 4,19, incluyendo el tracto gastrointestinal, el nervio vago y el nervio simpático. Es difícil determinar el papel preciso de los metabolitos derivados del intestino en el cerebro cuando se administran los metabolitos a través de rutas periféricas. Este artículo presenta un protocolo basado en video para investigar los efectos de los metabolitos derivados del intestino en el cerebro de un ratón que se mueve libremente (Figura 1). Demostramos que los AGCC podían administrarse de forma aguda a través de la cánula guía durante las pruebas de comportamiento. El tipo, el volumen y la velocidad de infusión de los metabolitos pueden modificarse dependiendo del propósito. El sitio de canulización se puede ajustar para explorar el impacto de los metabolitos intestinales en una región específica del cerebro. Nuestro objetivo es proporcionar a los científicos un método para explorar el impacto potencial de los metabolitos microbianos derivados del intestino en el cerebro y el comportamiento.

Protocol

Todos los protocolos experimentales y el cuidado de los animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Nacional Cheng Kung (NCKU). 1. Preparación para el animal de experimentación Obtenga ratones machos C57BL / 6JNarl de tipo salvaje de 6-8 semanas de edad de un proveedor. Aloje a los ratones en una jaula de ratón estándar con comida de ratón estándar y agua esterilizada ad libitum</em…

Representative Results

El ratón fue infundido con AGCC 1 semana después de la recuperación de la implantación de la cánula guía para evaluar la actividad locomotora en una nueva jaula. El ratón se colocó en una jaula novedosa y se infundió con 2.100 nL de AGCC o ACSF en los primeros 5 minutos (tasa de entrega de 7 nL / s) en el cerebro a través de la cánula de guía comercial implantada en el ventrículo lateral del cerebro. La actividad locomotora en una nueva jaula se registró durante 30 minutos adicionales después de la infusi?…

Discussion

Los metabolitos derivados del intestino se han asociado con enfermedades mediadas por el cerebro sin mucho mecanismo preciso, en parte debido a sus múltiples sitios de unión en el cuerpo 6,12,24. Informes anteriores indicaron que los AGCC podrían servir como ligandos para receptores acoplados a proteínas G, reguladores epigenéticos y fuentes de producción de energía en múltiples sitios del cuerpo …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Reconocemos al personal del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Nacional Cheng Kung (NCKU) por cuidar a los animales. Este trabajo fue apoyado por la beca del Fondo de Educación Prof. Kun-Yen Huang de la Fundación Médica CHENG-HSING a C.-W.L.; los fondos del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST) en Taiwán: (Investigación de pregrado MOST 109-2813-C-006-095-B) a T.-H.Y.; (MOST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) a W.-L.W.; y el Proyecto Brote de Educación Superior, Ministerio de Educación a la Sede de Avance Universitario en NCKU a W.-L.W.

Materials

Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383
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Liou, C., Yao, T., Wu, W. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).
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