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Neuroscience

Livraison intrarébroventriculaire de métabolites microbiens dérivés de l’intestin chez des souris en mouvement libre

Published: June 02, 2022
doi:
10.3791/63972
, ,
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine,National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine,National Cheng Kung University

Summary

Les métabolites microbiens dérivés de l’intestin ont des effets multiformes conduisant à un comportement complexe chez les animaux. Notre objectif est de fournir une méthode étape par étape pour délimiter les effets des métabolites microbiens dérivés de l’intestin dans le cerveau via une administration intrarébroventriculaire via une canule guide.

Abstract

L’impact du microbiote intestinal et de ses métabolites sur la physiologie et le comportement de l’hôte a été largement étudié au cours de cette décennie. De nombreuses études ont révélé que les métabolites dérivés du microbiote intestinal modulent les fonctions physiologiques à médiation cérébrale par des voies complexes intestin-cerveau chez l’hôte. Les acides gras à chaîne courte (AGCC) sont les principaux métabolites dérivés de bactéries produits lors de la fermentation des fibres alimentaires par le microbiome intestinal. Les AGCC sécrétés par l’intestin peuvent agir sur plusieurs sites à la périphérie, affectant les réponses immunitaires, endocriniennes et neuronales en raison de la vaste distribution des récepteurs des AGCC. Par conséquent, il est difficile de différencier les effets centraux et périphériques des AGCC par administration orale et intrapéritonéale d’AGCC. Cet article présente une méthode vidéo pour interroger le rôle fonctionnel des AGCC dans le cerveau via une canule guide chez des souris en mouvement libre. La quantité et le type d’AGCC dans le cerveau peuvent être ajustés en contrôlant le volume et le débit de perfusion. Cette méthode peut fournir aux scientifiques un moyen d’apprécier le rôle des métabolites dérivés de l’intestin dans le cerveau.

Introduction

Le tractus gastro-intestinal humain abrite divers micro-organismes ayant un impact sur l’hôte 1,2,3. Ces bactéries intestinales peuvent sécréter des métabolites dérivés de l’intestin lors de leur utilisation des composants alimentaires consommés par l’hôte 4,5. Fait intéressant, les métabolites intestinaux non métabolisés à la périphérie peuvent être transportés vers d’autres organes par la circulation6. Il convient de noter que ces métabolites sécrétés peuvent servir de médiateurs pour l’axe intestin-cerveau, défini comme la communication bidirectionnelle entre le système nerveux central et l’intestin7. Des études antérieures ont montré que les métabolites dérivés de l’intestin peuvent moduler le comportement complexe et les émotions chez les animaux 8,9,10,11.

Les acides gras à chaîne courte (AGCC) sont les principaux métabolites produits par le microbiote intestinal lors de la fermentation des fibres alimentaires et des glucides non digestibles6. L’acétate, le propionate et le butyrate sont les AGCC les plus abondants dans l’intestin12. Les AGCC servent de source d’énergie pour les cellules du tractus gastro-intestinal. Les AGCC non métabolisés dans l’intestin peuvent être transportés vers le cerveau par la veine porte, modulant ainsi le cerveau et le comportement 6,12. Des études antérieures ont suggéré que les AGCC pourraient jouer un rôle essentiel dans les troubles neuropsychiatriques 6,12. Par exemple, l’injection intrapéritonéale de butyrate chez des souris BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR), un modèle animal de trouble du spectre autistique (TSA), a sauvé leurs déficits sociaux13. Les rats traités aux antibiotiques recevant le microbiote de sujets dépressifs ont montré une augmentation des comportements anxieux et des AGCC fécaux14. Sur le plan clinique, des altérations des taux d’AGCC fécaux ont été observées chez les personnes atteintes de TSA par rapport aux témoins en développement typique15,16. Les personnes souffrant de dépression ont des taux d’AGCC fécaux inférieurs à ceux des sujets sains17,18. Ces études suggèrent que les AGCC peuvent modifier le comportement des animaux et des humains par diverses voies.

Les métabolites microbiens exercent divers effets sur de multiples sites dans le corps, affectant la physiologie et les comportements de l’hôte 4,19, y compris le tractus gastro-intestinal, le nerf vague et le nerf sympathique. Il est difficile de déterminer le rôle précis des métabolites dérivés de l’intestin dans le cerveau lors de l’administration des métabolites par des voies périphériques. Cet article présente un protocole vidéo pour étudier les effets des métabolites dérivés de l’intestin dans le cerveau d’une souris en mouvement libre (Figure 1). Nous avons montré que les AGCC pouvaient être administrés de manière aiguë par la canule guide pendant les tests comportementaux. Le type, le volume et le débit de perfusion des métabolites peuvent être modifiés en fonction de l’objectif. Le site de canulation peut être ajusté pour explorer l’impact des métabolites intestinaux dans une région spécifique du cerveau. Notre objectif est de fournir aux scientifiques une méthode pour explorer l’impact potentiel des métabolites microbiens dérivés de l’intestin sur le cerveau et le comportement.

Protocol

Tous les protocoles expérimentaux et les soins des animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université nationale Cheng Kung (NCKU). 1. Préparation pour l’animal d’expérimentation Procurez-vous des souris mâles C57BL/6JNarl de type sauvage âgées de 6 à 8 semaines auprès d’un fournisseur. Abritez les souris dans une cage à souris standard avec un chow de souris standard et…

Representative Results

La souris a reçu des AGCC 1 semaine après la récupération de l’implantation de la canule guide pour évaluer l’activité locomotrice dans une nouvelle cage. La souris a été placée dans une nouvelle cage et perfusée avec 2 100 nL d’AGCC ou d’ACSF dans les 5 premières minutes (taux d’administration de 7 nL/s) dans le cerveau par la canule guide commerciale implantée dans le ventricule latéral du cerveau. L’activité locomotrice dans une nouvelle cage a été enregistrée pendant 30 minutes supplémen…

Discussion

Les métabolites dérivés de l’intestin ont été associés à des maladies à médiation cérébrale sans mécanisme très précis, en partie à cause de leurs multiples sites de liaison dans le corps 6,12,24. Des rapports antérieurs indiquaient que les AGCC pouvaient servir de ligands pour les récepteurs couplés aux protéines G, les régulateurs épigénétiques et les sources de production d’énergie à plusieurs end…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le personnel du Centre des animaux de laboratoire de l’Université nationale Cheng Kung (NCKU) pour avoir pris soin des animaux. Ce travail a été soutenu par la bourse du Fonds d’éducation du professeur Kun-Yen Huang de la Fondation médicale CHENG-HSING à C.-W.L.; les fonds du Ministère de la science et de la technologie (MOST) à Taïwan : (Undergraduate Research MOST 109-2813-C-006-095-B) à T.-H.Y.; (MOST 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) à W.-L.W.; et le projet de germination de l’enseignement supérieur, du Ministère de l’éducation au siège de l’avancement universitaire à NCKU à W.-L.W.

Materials

Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383
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References

  1. Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
  2. Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).
  3. Sharon, G., Sampson, T. R., Geschwind, D. H., Mazmanian, S. K. The central nervous system and the gut microbiome. Cell. 167 (4), 915-932 (2016).
  4. Krautkramer, K. A., Fan, J., Backhed, F. Gut microbial metabolites as multi-kingdom intermediates. Nature Reviews: Microbiology. 19 (2), 77-94 (2021).
  5. Lavelle, A., Sokol, H. Gut microbiota-derived metabolites as key actors in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 223-237 (2020).
  6. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota-gut-brain communication. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 16 (8), 461-478 (2019).
  7. Morais, L. H., Schreiber, H. L. T., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews: Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  8. Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
  9. St Laurent, R., O’Brien, L. M., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson’s disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  10. Govindarajan, N., Agis-Balboa, R. C., Walter, J., Sananbenesi, F., Fischer, A. Sodium butyrate improves memory function in an Alzheimer’s disease mouse model when administered at an advanced stage of disease progression. Journal of Alzheimer’s Disease. 26 (1), 187-197 (2011).
  11. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  12. Silva, Y. P., Bernardi, A., Frozza, R. L. The role of short-chain fatty acids from gut microbiota in gut-brain communication. Frontiers in Endocrinology. 11, 25 (2020).
  13. Kratsman, N., Getselter, D., Elliott, E. Sodium butyrate attenuates social behavior deficits and modifies the transcription of inhibitory/excitatory genes in the frontal cortex of an autism model. Neuropharmacology. 102, 136-145 (2016).
  14. Kelly, J. R., et al. Transferring the blues: Depression-associated gut microbiota induces neurobehavioural changes in the rat. Journal of Psychiatric Research. 82, 109-118 (2016).
  15. Wang, L., et al. Elevated fecal short chain fatty acid and ammonia concentrations in children with autism spectrum disorder. Digestive Diseases and Sciences. 57 (8), 2096-2102 (2012).
  16. Adams, J. B., Johansen, L. J., Powell, L. D., Quig, D., Rubin, R. A. Gastrointestinal flora and gastrointestinal status in children with autism–comparisons to typical children and correlation with autism severity. BMC Gastroenterology. 11, 22 (2011).
  17. Skonieczna-Zydecka, K., et al. Faecal short chain fatty acids profile is changed in Polish depressive women. Nutrients. 10 (12), 1939 (2018).
  18. Szczesniak, O., Hestad, K. A., Hanssen, J. F., Rudi, K. Isovaleric acid in stool correlates with human depression. Nutritional Neuroscience. 19 (7), 279-283 (2016).
  19. Martin, A. M., Sun, E. W., Rogers, G. B., Keating, D. J. The influence of the gut microbiome on host metabolism through the regulation of gut hormone release. Frontiers in Physiology. 10, 428 (2019).
  20. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. . Paxinos and Franklin’s The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
  21. York, J. M., Blevins, N. A., McNeil, L. K., Freund, G. G. Mouse short- and long-term locomotor activity analyzed by video tracking software. Journal of Visualized Experiments. (76), e50252 (2013).
  22. Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice. Journal of Visualized Experiments. (164), e61023 (2020).
  23. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments. (168), e61941 (2021).
  24. Needham, B. D., Kaddurah-Daouk, R., Mazmanian, S. K. Gut microbial molecules in behavioural and neurodegenerative conditions. Nature Reviews: Neuroscience. 21 (12), 717-731 (2020).
  25. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  26. Xiaoguang, W., et al. Establishment of a valuable mimic of Alzheimer’s disease in rat animal model by intracerebroventricular injection of composited amyloid beta protein. Journal of Visualized Experiments. (137), e56157 (2018).
  27. Venniro, M., Shaham, Y. An operant social self-administration and choice model in rats. Nature Protocols. 15 (4), 1542-1559 (2020).
  28. Ucal, M., et al. Rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines. Journal of Visualized Experiments. (175), e57879 (2021).
  29. Oberrauch, S., et al. Intraventricular drug delivery and sampling for pharmacokinetics and pharmacodynamics study. Journal of Visualized Experiments. (181), e63540 (2022).
  30. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injections of the enteric bacterial metabolic product propionic acid impair cognition and sensorimotor ability in the Long-Evans rat: further development of a rodent model of autism. Behavioural Brain Research. 200 (1), 33-41 (2009).
  31. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injection of propionic acid, an enteric metabolite implicated in autism, induces social abnormalities that do not differ between seizure-prone (FAST) and seizure-resistant (SLOW) rats. Behavioural Brain Research. 278, 542-548 (2015).
  32. Perry, R. J., et al. Acetate mediates a microbiome-brain-beta-cell axis to promote metabolic syndrome. Nature. 534 (7606), 213-217 (2016).
  33. Muller, P. A., et al. Microbiota modulate sympathetic neurons via a gut-brain circuit. Nature. 583 (7816), 441-446 (2020).
  34. Pardridge, W. M. CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (7), 963-975 (2016).
  35. Wu, J. -. T., et al. Oral short-chain fatty acids administration regulates innate anxiety in adult microbiome-depleted mice. Neuropharmacology. , (2022).
  36. Lee, J., et al. Gut microbiota-derived short-chain fatty acids promote poststroke recovery in aged mice. Circulation Research. 127 (4), 453-465 (2020).
  37. Chiu, C., et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 3 (2012).
  38. Schuler, B., Rettich, A., Vogel, J., Gassmann, M., Arras, M. Optimized surgical techniques and postoperative care improve survival rates and permit accurate telemetric recording in exercising mice. BMC Veterinary Research. 5, 28 (2009).
  39. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  40. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  41. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  42. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
  43. Wolter, J. M., et al. Cas9 gene therapy for Angelman syndrome traps Ube3a-ATS long non-coding RNA. Nature. 587 (7833), 281-284 (2020).
  44. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses for combinatorial cell-subclass-specific labeling. Neuron. 109 (9), 1449-1464 (2021).
  45. Xie, M., et al. TREM2 interacts with TDP-43 and mediates microglial neuroprotection against TDP-43-related neurodegeneration. Nature Neuroscience. 25 (1), 26-38 (2022).
  46. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  47. Bermudez-Martin, P., et al. The microbial metabolite p-Cresol induces autistic-like behaviors in mice by remodeling the gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 157 (2021).
  48. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  49. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).
  50. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  51. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  52. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  53. Kaelberer, M. M., et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. Science. 361 (6408), (2018).
  54. Needham, B. D., Tang, W., Wu, W. L. Searching for the gut microbial contributing factors to social behavior in rodent models of autism spectrum disorder. Developmental Neurobiology. 78 (5), 474-499 (2018).
  55. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
  56. Chu, C., et al. The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning. Nature. 574 (7779), 543-548 (2019).
  57. Wu, W. L., et al. Microbiota regulate social behaviour via stress response neurons in the brain. Nature. 595 (7867), 409-414 (2021).
  58. Buchanan, K. L., et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).
  59. Han, W., et al. A neural circuit for gut-induced reward. Cell. 175 (3), 665-678 (2018).
  60. Yamawaki, Y., et al. Antidepressant-like effect of sodium butyrate (HDAC inhibitor) and its molecular mechanism of action in the rat hippocampus. World Journal of Biological Psychiatry. 13 (6), 458-467 (2012).
  61. Ho, L., et al. Protective roles of intestinal microbiota derived short chain fatty acids in Alzheimer’s disease-type beta-amyloid neuropathological mechanisms. Expert Review of Neurotherapeutics. 18 (1), 83-90 (2018).
  62. Liu, J., et al. Anti-neuroinflammatory effect of short-chain fatty acid acetate against Alzheimer’s disease via upregulating GPR41 and inhibiting ERK/JNK/NF-kappaB. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (27), 7152-7161 (2020).
  63. van de Wouw, M., et al. Short-chain fatty acids: microbial metabolites that alleviate stress-induced brain-gut axis alterations. Jounal of Physiology. 596 (20), 4923-4944 (2018).
  64. Olson, C. A., et al. The gut microbiota mediates the anti-seizure effects of the ketogenic diet. Cell. 173 (7), 1728-1741 (2018).
  65. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).

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Liou, C., Yao, T., Wu, W. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).
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