שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

1. ריאגנטים וציוד הכינו מאגרים טריים כמפורט בטבלה 1. יש להשתמש במים אולטרה-טהורים שעברו דה-יוניזציה עם התנגדות של 18.2 MΩ·cm ב-25°C. עקר את כל המאגרים על ידי העברתם דרך מסנני 0.22 מיקרומטר תחת ואקום. דגה את המאגרים המשמשים לכרומטוגרפיה של עמודות. לטהר את אקטין שרירי השלד כפי שתואר קודםלכן 18,19. הוסיפו 20% גליצרול לתמיסת ה-G-אקטין המטוהרת הסופית וצרו אליקוטים של 500 μL (לניסויים בהתוויה או לניסויים בתפזורת) ונפח של 10 μL (לניסויים בודדים). הבזק להקפיא את aliquots על ידי טבילת הצינורות בחנקן נוזלי במשך 30 שניות ולאחר מכן לאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס עד 18 חודשים.הערה: לחלופין, ניתן לרכוש אבקת אקטין או אצטון מטוהרת באופן מסחרי. תייג G-actin של שרירי שלד מטוהרים עם כל צבעי maleimide פלואורסצנטיים כפי שתואר קודםלכן 5. קבע את הריכוז ואת מידת הסימון של החלבון על ידי ספקטרופוטומטריה באמצעות תיקון A290nm עבור אקטין (εactin = 26,600 M-1 cm-1) ו-A λmax של הצבע. בצע aliquots של 10 μL והקפאת הבזק על ידי טבילת הצינורות בחנקן נוזלי למשך 30 שניות ואחסון בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס למשך עד 18 חודשים.הערה: תיוג עם אסטרים של NHS מצומדים לליזין ייצור אקטין שאינו מתפקד ויש להימנע ממנו. לטהר את שריר השלד מיוזין II על ידי ביצוע פרוטוקול20. הפעל את SDS-PAGE באמצעות 10% ג’ל פוליאקרילאמיד ואחריו צביעת Coomassie כדי לקבוע את רמת הטוהר של החלבון21. יש לאחסן מיוזין שרירי שלד מטוהרים בטמפרטורה של −20°C בצורה נוזלית במאגר מיוזין II עם 50% גליצרול.הערה: ניתן להשתמש במיוזין II המאוחסן עד שנתיים. יש לסמן מיוזין-II מטוהר עם כל צבעי מאלימיד פלואורסצנטיים כפי שתואר קודםלכן 5. הימנע תיוג מנועי מיוזין עם צבעי NHS-esters. קבע את הריכוז ואת מידת הסימון על ידי ספקטרופוטומטריה באמצעות תיקון A280nm של מיוזין II ו- A λmax של הצבע. יש לאחסן את המיוזין II הממוחזר (כהה או מסומן) בטמפרטורה של 4°C ולהשתמש תוך 6 שבועות. טיהור חלבון מכסההשג חלבון מכסה מורין על ידי ביצוע פרוטוקולמוקדם יותר 22. הפעל את SDS-PAGE באמצעות 10% ג’ל פוליאקרילאמיד ואחריו צביעת Coomassie כדי לקבוע את רמת הטוהר של החלבון. מדוד את הריכוז באמצעות280nm של חלבון מכסה (εCP = 99,530 M-1 cm-1). הוסיפו 20% גליצרול לתמיסת החלבון וצרו 5 μL aliquots בצינורות PCR של 200 μL. צללו את הצינורות לחנקן נוזלי ואחסנו אותם בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס למשך עד שנתיים.הערה: פעילות חלבון המכסה נבדקת על-ידי פילמור כמויות קבועות של G-אקטין פלואורסצנטי בנוכחות כמויות חלבון מכסות שונות. לאחר מכן מדמיינים את החוטים תחת מיקרוסקופ, והתפלגות אורכם ניתנת לכימות. ככל שהריכוז היחסי של חלבון המכסה גבוה יותר, כך התפלגות חוטי האקטין קצרה יותר. ראו Köster et al.5. בטא חלבון מקשר ממברנה-אקטין פלואורסצנטי, למשל, עבור פרוטוקול זה השתמש ב-10xHis-YFP-EzrinABD (HYE), בטא אותו ב-Bl21DE3* Escherichia Coli, וטהר כפי שתואר קודםלכן 23. קבע את ריכוז החלבון על ידי ספקטרופוטומטריה. אחסנו את החלבון באליקוטים קטנים במאגר כרומטוגרפיה של סינון ג’ל (או כל חיץ מתאים אחר) עם 20% גליצרול בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. בתנאים אלה, החלבון יציב במשך למעלה משנתיים.הערה: הבחירה בחלבון מקשר אקטין-ממברנה וסמן פלואורסצנטי תלויה בסוג השאלה שאדם מתייחס אליה. מגוון רחב של אסטרטגיות לקישור שומנים פותחו בשנים האחרונות, כולל חלבונים המתויגים על ידי היסטידין 24, ביוטין-סטרפטווידין25 ו-DNA חד-גדילי26. הכנת שלפוחית מולטי-למלרית (MLVs)הערה: זרימת העבודה מ-MLVs ל-bilayers של שומנים נתמכים מתוארת באיור 2.מניחים 5-10 בקבוקוני זכוכית ענבר בכוס זכוכית של 200 מ”ל. מלאו את הכוס בתמיסת ניקוי של 2%, מספיק כדי להטביע את בקבוקוני הזכוכית. סוניקו אותם באמבט מים למשך 30 דקות בדופק מלא ו-65 מעלות צלזיוס. מוציאים את הבקבוקונים מהתמיסה ושוטפים אותם היטב במים מזוקקים. מניחים את הבקבוקונים בכוס זכוכית המכילה 2 N NaOH וסוניקים למשך 20 דקות. בשלב זה אין צורך בחימום. יש להוציא את הבקבוקונים מתמיסת NaOH ולשטוף היטב במים מזוקקים. יבשו את הבקבוקונים בתוך תנור אוויר חם בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעתיים או יותר. אחסנו את הבקבוקונים המנוקים בכוס נקייה אטומה בסרט שקוף למשך עד 6 שבועות.התראה: בצע את השלבים הבאים בתוך מכסה אדים כימיים. טפל בכלורופורם ובתמיסות השומנים באמצעות מזרקי זכוכית המילטון אטומים לגז כדי למנוע זיהום על ידי פלסטיק. שטפו את מזרקי המילטון וכמה בקבוקוני זכוכית ענבר מספר פעמים עם כלורופורם טהור. קח את אבקת השומנים המאוחסנת באמפולות זכוכית מהמקפיא של −20 מעלות צלזיוס והוסף כמויות מספיקות של כלורופורם כדי להמיס את אבקות השומנים לריכוזים של 10-25 מ”ג/מ”ל. העבירו את התמיסה מהאמפולה לבקבוקון זכוכית ענבר שזה עתה נוקה ותייגו אותה בהתאם. בצע שלב זה על קרח כדי להפחית אידוי של כלורופורם. צור תמיסת מלאי DOPC עם ריכוז של 10-25 מ”ג/מ”ל ו-DGS-NTA-Ni2+ בריכוז של 1-10 מ”ג/מ”ל. כדי ליצור תערובת שומנים עובדת, קחו בקבוקון זכוכית נקי ושטפו אותו פי 2 עם כלורופורם. הוסיפו 300 מיקרוגרם של כלורופורם טהור לבקבוקון כדי לשמש בסיס לערבוב טוב יותר של הרכיבים. זה לא ישפיע על הריכוזים הסופיים של השומנים מכיוון שכל הכלורופורם יתייבש בשלבים הבאים. הוסיפו כמויות מדודות של תמיסות שומנים לבקבוקון כדי ליצור את תערובות השומנים הפועלות הרצויות. ריכוז השומנים היעד בחיץ התייבשות השומנים הוא 4 mM. יבשו את תערובת השומנים תחת זרם איטי של גז N2 בתוך מכסה המנוע הכימי בטמפרטורת החדר. שלב זה עשוי להימשך עד 30 דקות עבור כל בקבוקון. לאחר שכל הממס התייבש, יש לייבש את שכבת השומנים בוואקום למשך >2 שעות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את שאריות הכלורופורם. החזירו את תערובת השומנים המיובשים בחיץ התייבשות השומנים לקבלת ריכוז שומנים סופי של 4 mM. דגירה במשך 5-10 דקות כדי לאפשר התייבשות של השומנים. וורטקס תמיסת השומנים במשך כ-30 שניות ליצירת MLVs. הפוך 0.5-1 מ”ל aliquots של MLVs ב 1.5 מ”ל צינורות microcentrifuge. צללו את הצינורות בחנקן נוזלי, אטמו עם סרט שקוף ואחסנו בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס (עד 6 שבועות).הערה: ריכוזי מלאי השומנים נבחרים כדי לאפשר כמויות גדולות מספיק המאפשרות צנרת אמינה באמצעות מזרקי המילטון. אם הנפחים הדרושים להכנת הציר גדולים מכדי להמיס את אבקת השומנים המיובשת, בצעו דילולים מרובים של הציר כדי להבטיח ערבוב בר-שחזור של שומנים שונים. הכנת שלפוחיות חד-עיניות קטנות (רכבי שטח)הוציאו כמות גדולה של רכבי MLV מהאחסון בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס והפשירו אותה בטמפרטורת החדר. הבזק להקפיא את הבועיות על ידי צלילת צינור microcentrifuge בחנקן נוזלי במשך 15-30 שניות ומיד לשים אותו באמבט מים להגדיר ב 45 מעלות צלזיוס עד הפתרון הפשיר לחלוטין (1-2 דקות). חזור על מחזור ההקפאה הנ”ל 10x-15x עד שהפתרון נראה פחות עכור.הערה: הגדר את הטמפרטורה של אמבט המים לגבוהה מטמפרטורת המעבר של תערובת השומנים המופשרת כדי לאפשר ערבוב שומנים אחיד. שיווי משקל מכבש מיני מבוסס מזרק המצויד בקרום מסנן פוליקרבונט בגודל 80 ננומטר עם חיץ התייבשות SUV. ודא שאין דליפה או בועות במערכת. בעוד ששיטת האקסטרוזיה מניבה רכבי שטח חד-פעמיים עם נזק מינימלי לשומנים, תערובות שומנים עם מטען שלילי יכולות להידבק לממברנת הפוליקרבונט. מעבירים בעדינות את תמיסת השומנים המופשרת דרך האקסטרודר הטרום-שיווי משקל מצד לצד ואז בחזרה. חזור על המחזור 5x-10x עד שתמיסת השומנים תהפוך ברורה בעליל, המציינת היווצרות של רכבי שטח בקוטר ~ 100 ננומטר. צנטריפוגה של המתלים המובלטים (או קצה סוניקטור של התמיסה; ראו הערה בהמשך) ב-15,000 x גרם למשך 60 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להוריד את פסולת השומנים. לאסוף את 80% העליונים של הפתרון מבלי להפריע את הכדור ובלי ליצור בועות. העבירו את הסופר-נאטנט המכיל את רכבי השטח לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי ואחסנו על קרח עד 6 ימים.הערה: חלופה לצנטריפוגה היא סוניקציית קצה המבוצעת באופן הבא. הפעל סוניק microtip וקבע את ההגדרות הבאות: משרעת = 30% מהמקסימום, ON time = 10 שניות, זמן כיבוי = 60 שניות. נקו את קצה המיקרו-סוניקטור במים שעברו דה-יוניזציה ואחריהם 2 N NaOH, כלורופורם, ושוב מים שעברו דה-יוניזציה. טבלו את קצה הסוניקטור בכל אחד מהפתרונות הללו וסוניק במשך 1-2 מחזורים באמצעות ההגדרות לעיל. טובלים את הקצה הנקי בתמיסת השלפוחית המופשרת בהקפאה ומסננים במשך 3-6 מחזורים על קרח עד שהתמיסה מתבהרת. לאחר צנטריפוגה, בדוק אם יש סימנים של השפלת שומנים גבוהה או שחול שומנים כושל כמו היווצרות של סרט לבנבן דק ו / או גלולה גלויה בבירור. במקרים אלה, אין להמשיך ולחזור שוב על שלבי ההכנה של רכב השטח.הערה: חיי המדף של רכבי שטח עשויים להיות שונים עבור תערובות שומנים שונות. רכבי שטח העשויים מ-DOPC: DGS-NTA-Ni2+ יציבים עד 6 ימים לצורך ניסויים אלה. עצות לפתרון בעיות נפוצות ניתן למצוא בטבלה 2. איור 2: סכמת המציגה את זרימת העבודה, החל מהכנת שלפוחיות רב-לשוניות ושלפוחיות חד-עיניות קטנות ועד להיווצרות דו-שכבתיות שומנים נתמכות. נוצר עם ביורנדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. 2. שחזור של רשתות אקטין הקשורות לממברנה הכנת תאי דגימהקחו 3-5 כיסויי זכוכית מלבניים והניחו אותם בתוך צנצנת קופלין. הפעל את סוניק האמבטיה והגדר את הטמפרטורה ל -65 מעלות צלזיוס. מלאו את צנצנת ה-Coplin בתמיסת ניקוי של 2% כדי להטביע את הכיסויים במלואם והכניסו אותה לסוניק למשך 30 דקות במצב פולס מלא. השתמשו במלקחיים קהים בציפוי PTFE כדי להסיר את הכיסויים בזה אחר זה מהצנצנת. שטפו אותם היטב במים מזוקקים והניחו אותם בצנצנת קופלין אחרת מלאה ב-2 N NaOH. סונו את הכיסויים למשך 20 דקות במצב דופק מלא. מוציאים את הכיסויים בזה אחר זה, שוטפים היטב במים מזוקקים ומניחים בצנצנת קופלין אחרת מלאה במים מזוקקים.הערה: לחלופין, יש לנתק את הכיסויים במים מזוקקים למשך 20 דקות ולאחר מכן לשטוף אותם שוב במים מזוקקים. מיד לפני תחילת הניסוי, קחו את הצנצנת המכילה את הכיסויים במכסה מנוע כימי המצויד באספקת גז N2 . מטב את לחץ האוויר של זרם הגז N2 על ידי ניסוי וטעייה, כך שהוא מספיק כדי להזיז מים ממשטח הכיסוי מבלי לשבור אותו. יישרו את הזרימה של גז N2 במקביל למישור הכיסוי כדי להפחית את האפשרות של שבירת הכיסוי. השתמשו בכפפות ובמלקחיים כדי להסיר את הכיסויים בזה אחר זה מהצנצנת כדי לייבש אותם מתחת לזרם N2 . יבשו את שני הצדדים של כל כיסוי והניחו אותם על רשת פלסטיק נקייה עם כיסוי. הניחו את הקופסה עם הכיסויים בתוך חומר ייבוש כדי למנוע מגע עם חלקיקי אבק באוויר.הערה: ניתן לאחסן את הכיסויים המיובשים N2 במייבש שיער, שם הם יכולים להישאר הידרופיליים עד יומיים. אסטרטגיה זו עשויה להיות שימושית כאשר נדרשים דו-שכבתיים רבים לניסוי או אם הניסוי אורך יותר מ-8 שעות. קח צינורות PCR autoclaved לחתוך את העפעפיים שלהם ואת חצאים חרוטיים נמוכים עם להב כירורגי חד. קח את הצינורות הגליליים החתוכים למחצה בזה אחר זה, מרח דבק הניתן לריפוי UV על השפה החלקה של כל צינור חיתוך, והנח אותו הפוך על כיסוי שניקה זה עתה, כך שהשפה יושבת שטוחה על הכיסוי. אין להזיז את הצילינדר לרוחב ברגע שהוא ממוקם על המכסה כדי להבטיח שהדבק לא יישפך לחלל המרכזי של התא. כיסויים מלבניים יכולים להכיל בנוחות עד שלושה תאי תגובה, והעגולים יכולים להכיל רק אחד במרכז (איור 1). שים את הכיסויים נושאי התא בתוך שואב אוזון UV עם אספקת O2 ואקום (או השתמש בתאורת UV). הפעל את אור ה- UV והאיר למשך 3-5 דקות כדי לאפשר לדבק להתפלמר. בצע תאורה ארוכה יותר (10-15 דקות) כדי לשפר את ההידרופיליות של זכוכית הכיסוי, ומכאן, את איכות דו-שכבת השומנים. אחסנו את תאי הדגימה היבשים המוארים ב-UV למשך עד 8 שעות בתוך קופסאות פלסטיק קטנות (כגון קופסאות כיסוי מלבניות ריקות) עטופות בסרט שקוף כדי להפחית את המגע עם חלקיקי אבק באוויר.הערה: זרם קבוע של O2 בנוכחות אור UV יוצר רדיקלים של אוזון וחמצן שיכולים להסיר זיהומים אורגניים מפני השטח של הכיסוי. ואקום ימנע דליפה של אוזון רעיל שנוצר במהלך התהליך. הוציאו את הכיסויים ובדקו אם יש דליפה בתאים על ידי מילוים במים מזוקקים. כל תא יכול להכיל עד ~ 150 μL של דגימה. השליכו את התאים הדולפים.הערה: אפשרות ניקוי נהדרת ובטוחה נוספת היא מנקה הפלזמה. הגדרות הזמן והחשמל תלויות בדגם, אך הקפידו לא לטפל יתר על המידה בשקופיות הזכוכית עם פלזמה מכיוון שהדבר יביא להפחתת ניידות השומנים. טיפול פני השטח יכול להשפיע על הניידות של שומנים27, כפי שנצפה עם טיפול ממושך עם פתרון ניקוי (>45 דקות) או NaOH (>30 דקות). הכנת דו-שכבתי שומנים נתמכיםשטפו כל תא עם חיץ היווצרות SLB (או 1x PBS) כדי להסיר מזהמים על פני השטח, והשאירו 100 μL של חיץ בסוף. סמן את רמת המאגר ב- 100 μL עם סמן קבוע כדי לעקוב אחר שינויים בנפח. הוסף 2 μL של 0.1 M CaCl2 לתא. זה משפר את ספיחת הבועיות אל משטח הזכוכית, שיפור היווצרות bilayer בשלב הבא. הוסף 8 μL מתמיסת SUV (משלב 1.10.) לכל תא ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.הערה: ניתן להעריך את נפח תערובת ה- SUV שיש להוסיף על ידי חישוב המספר הכולל של שומנים (עם שטח ממוצע של 0.72 ננומטר2) הדרושים כדי לכסות לחלוטין את האזור ההידרופילי החשוף של הבאר בשתי שכבות שומנים. שטפו את הבועיות הלא מאוגדות עם חיץ תנועתיות אקטין (1x KMEH). ראשית, הסר 50 μL של חיץ היווצרות SLB, משאיר רק 50 μL בתא הדגימה. שנית, להוסיף 100 μL של 1x KMEH לתא. מערבבים בעדינות ולאחר מכן מסירים 100 μL של החיץ מבלי לגעת בתחתית.הערה: חשוב להיות עדינים בזמן הכביסה. ודא שקצה הפיפטה אינו נוגע בתחתית התא. שמור על הפיפטה נוטה לכוון את זרימת החיץ לדופן התא ולא ישירות אל הדו-שכבתי, שכן זרימה ישירה עלולה לשבש את הדו-שכבתי. יש להיזהר שלא להכניס בועות אוויר בזמן הצנרת, שכן האוויר עלול להגיע לדו-שכבת השומנים ולגרום לפגמים בו. חזור על הכביסה 10x על ידי הוספת 100 μL של 1x KMEH והסרת 100 μL. הוסיפו 10 μL של 1 מ”ג/מ”ל β-קזאין לדו-שכבתי, ערבבו בעדינות ודגרו במשך 5-10 דקות. β-קזאין חוסם את האזורים על הכיסוי שבהם הדו-שכבתי לא נוצר. יש לשטוף β-קזאין 3x עם 1x KMEH כמתואר בשלב 2.2.3. ולהחזיר את רמת המאגר ל-100 μL. תוספת של מקשר ממברנה-אקטיןבמהלך הדגירה של β-קזאין (שלב 2.2.5.), מוציאים אליקוט של חלבון מקשר ממברנה-אקטין מ-80 מעלות צלזיוס, מפשירים אותו במהירות ב-37 מעלות צלזיוס, ואז שומרים אותו על קרח. דללו את האליקוט עם מאגר דילול חלבונים לריכוז של 1 μM. מוסיפים את חלבון המקשר בריכוז סופי מוגדר (בדרך כלל 5-20 ננומטר) ומערבבים בעדינות. כדי להבטיח שיווי משקל מהיר של החלבון בתא, הוסיפו נפחים הגדולים מ-20 μL על ידי ערבוב מראש של חלבון המקשר עם 1x KMEH. לדגור במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף 3x עם חיץ KMEH אחד כדי להסיר את חלבון HSE לא מאוגד (כמו בשלב 2.2.3.). החזירו את רמת החיץ בכל תא ל-100 μL. הדגימה מוכנה כעת להדמיה. הערכת איכות של דו-שכבת השומניםהערה: זהו שלב אופציונלי שאין צורך לבצע בכל פעם. אנו ממליצים לבצע הערכה זו בכל פעם שרכבי שטח טריים מיוצרים ממלאי MLV קפוא.הפעל את המיקרוסקופ, את לייזרי העירור ואת מצלמות האיתור. ודא שהלייזר מיושר, שהמטרה מנקה והתוכנה מוכנה להשיג תמונות. שים שמן על המטרה 100x, להרכיב את הדגימה על שלב המיקרוסקופ, ולמקד את המטרה על bilayer. ודא שמיקום הלייזר הוא כזה שהוא עובר השתקפות פנימית מוחלטת על הדגימה. השתמש בלייזר עירור של 488 ננומטר כדי לבדוק את התפלגות עוצמת הפלואורסצנטיות של 10xHis-YFP-EzrinABD הקשור לדו-שכבתי.הערה: דו-שכבתיות באיכות טובה מציגות התפלגות אחידה בקנה מידה גדול של עוצמת פלואורסצנטיות. דו-לשוניות רעות מראות כתמים פלואורסצנטיים עזים ומטושטשים. כדי לקבוע את שלמות הדו-שכבתי, בצע בדיקת FRAP.בחר אזור עניין ב- bilayer והקלט כמה תמונות של שדה הראייה באמצעות תנאי הדמיה המספקים יחס אות לרעש של 5:1 ומעלה. השהה את ההקלטה וסגור את דיאפרגמת השדה של מיקרוסקופ TIRF כדי למקד קרן לייזר מרוכזת על אזור מעגלי קטן של הדו-שכבתי כדי להלבין באופן מקומי את הפלואורופורים. הפעל את הלייזר לתפוקה המרבית שלו כדי לצלם את האזור הקטן למשך 3-10 שניות ולאחר מכן כבה את הלייזר. פתח מחדש את דיאפרגמת השדה לרדיוס המקורי שלה, התאם מחדש את מצב ההדמיה בחזרה להגדרות (לפני הלבנה), ומיד חדש כדי לרשום את התאוששות האות הפלואורסצנטי בשדה הראייה. בדוק אם הדו-שכבתי נוזל. דו-שכבות טובות עם דיפוזיה צידית רגילה מתאוששות מהר, בעוד שדו-שכבות רעות מתאוששות לאט או לא מתאוששות כלל (איור 3). אם הדו-שכבתי אינו מתאושש, בדוק את סעיף פתרון הבעיות והפעל מחדש. שמור את התמונות כקובצי TIFF של 16 סיביות. להערכה כמותית של מקדם הדיפוזיה, בדוק את שלב 3. מתחת. פילמור של אקטין פלואורסצנטיהערה: כדי לחסוך זמן, התחל בפולימריזציה של אקטין במהלך זמן הדגירה של חלבון HSE הנקשר לדו-שכבה (שלב 2.3.) או במהלך הערכת האיכות של הדו-שכבה (שלב 2.4.).ערבבו G-actin ללא תווית ומסומן פלואורסצנטי ביחס טוחן של 10:1 והוסיפו לו G-Buffer כך שריכוז ה-G-אקטין הוא 20 μM. הריכוז שבו אקטין הוא פולימריזציה סופית יהיה 1/4 מערך זה. הוסף 1/10 מתוך מאגר ME של 10x לתערובת לקבלת פתרון 1x ודגירה למשך 2 דקות. שלב זה מחליף את יוני Ca 2+ הקשורים ל-G-actin ביונים Mg2+. ודא שהנפח הסופי הוא בכפולות של 10 μL. הוסיפו את הכמות הרצויה של חלבון המכסה באופן הבא. הפשירו בקבוקון של לכידת מלאי החלבון במהירות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן שמרו אותו על קרח. יש לדלל עם G-buffer כך שריכוז החלבון המכסה כעת הוא כפול מהריכוז הסופי הרצוי בתערובת הפילמור. הוסף נפח שווה של תמיסת חלבון המכסה המדולל לתערובת האקטין משלב 2.5.1. לבסוף, הוסף נפח שווה של מאגר מטרה טרי פי 2 לתערובת התגובה. הנפח הסופי של התמיסה צריך להיות פי ארבעה מנפח תערובת האקטין בסוף שלב 2.5.2. ודא שהריכוז הסופי של KMEH הוא 1x, של ATP הוא 1 mM, של BSA הוא 1 מ”ג/מ”ל, ושל G-actin הוא 5 μM.דגירה בחושך ב-25 מעלות צלזיוס למשך 45-60 דקות כדי לאפשר פילמור לקרות.הערה: פעולה זו נקראת אסטרטגיית חיץ היעד, שבה נפח אחד של Mg 2+ G-actin (שלב 2.5.1.) מעורבב עם נפח אחד של תערובת חלבון capping (שלב 2.5.2.) ושני כרכים של מאגר יעד2x (שלב 2.5.3.). זה מקל על הגדלת או צמצום כמות האקטין ולשנות את הריכוז היחסי של חלבון מכסה (או כל אפנן אקטין אחר; איור 4). תוספת של חוטי אקטין פלואורסצנטייםחותכים כמה קצוות של 200 μL עם להב חד או מספריים כדי להפוך אותם לקצוות קהים. ספקו בעדינות את הנפח הנדרש של אקטין פולימרי 5 μM (משלב 2.5.3.) עם קצה פיפטה קהה (למניעת גזירה של חוטי אקטין) והוסיפו אותו לצינור PCR נקי. הוסיפו 1x KMEH לצינור כדי שהנפח >20 μL וערבבו בעדינות כדי למנוע גזירה של F-actin. מתא הדגימה המותקן, הסר נפח שווה של המאגר. מוסיפים את תמיסת האקטין הפולימרית לתא ומפזרים בעדינות למעלה ולמטה פי 3 מבלי לגעת בדו-שכבה שבתחתית. זה מאפשר חוטי אקטין להפיץ באופן אחיד על bilayer. הרכיבו את הדגימה על מיקרוסקופ TIRF (ראו שלב 2.4.1. ושלב 2.4.2.). ניתן לתעד את תהליך קשירת F-actin לדו-שכבתי. דגירה במשך 20-30 דקות. הקלט כמה תמונות משדות ראייה שונים לאחר שתוספת F-actin הגיעה למצב יציב. שימו לב לשינוי בארגון המרחבי של 10xHis-YFP-EzrinABD לפני (הומוגני) ואחרי ארגון אקטין.הערה: HYE מופץ באופן אחיד על פני דו-שכבת השומנים בהיעדר אקטין. עם תוספת של חוטי אקטין, HYE colocalizes עם F-actin. מידת הקולוקליזציה תלויה בזיקה המחייבת אקטין של החלבון המקשר; ככל שהזיקה חזקה יותר, כך הקולוקליזציה גבוהה יותר והניידות הצידית של החלבון המקשר איטית יותר (איור 5). תוספת של מיוזין IIלאחר 30 דקות של דגירה של אקטין, הרכיבו את הדגימה בחזרה על המיקרוסקופ (אם היא לא הייתה טעונה). בדוק את האות בתעלות חלבון המקשר ו- F-actin. התאם את תנאי ההדמיה במידת הצורך. בחר אזור טוב עם אות חלבון מקשר אחיד וחוטי אקטין מפוזרים באופן אחיד וללא ממצאים להקלטה בהילוך ארוך. הקלט 10-15 פריימים ב- 0.1-0.2 הרץ לפני הוספת מיוזין והשהה את ההקלטה. הוציאו את הנפח הנדרש של מיוזין-II שריר ממוחזר מבקבוקון המלאי עם קצה פיפטה קהה (כדי למנוע גזירה של חוטי מיוזין) והוסיפו לצינור PCR נקי. מיד להוסיף 1x KMEH לצינור כדי להפוך את הנפח >20 μL ומערבבים בעדינות. ניתן גם להוסיף ATP, תערובת התחדשות ATP, סוכני ייצוב תמונה וכו ‘. במהלך שלב זה. הסר בזהירות נפח שווה של המאגר מתא הדגימה המותקן מבלי להפריע לו. הוסיפו בעדינות את תמיסת המיוזין לתא הדגימה. אין לקטר מעלה ומטה מכיוון שהוא יפריע לחוטים הקשורים לפני השטח. מיד לחדש את רישום קיטועי הזמן ולצפות במערכת כפי שהיא מתפתחת ממצב טרום-מיוזין למצב acto-myosin המונע על ידי ATP והיווצרות אסטר למצב תקוע מדולדל ATP (ראה תוצאות מייצגות). צלם תמונות רקע עבור כל הערוצים באמצעות מדגם מאגר בלבד. שמור את כל התמונות כקבצי .tiff של 16 סיביות. עיין בטבלה 2 לקבלת עצות לפתרון בעיות נפוצות. איור 3: הערכת איכות של הדו-שכבתיים באמצעות בדיקת FRAP מהירה. דו-שכבתי שומנים נתמכים (SLBs) שהוכנו מליפידים DOPC ו-Ni-NTA (98:2 מול%) מצופים ב-HYE (מקשר ממברנה-אקטין מתויג 10xHis-YFP). לאחר שהחלבון הלא מאוגד נשטף החוצה, הדו-שכבה הפלואורסצנטית מצולמת תחת מיקרוסקופ TIRF. אזור קטן על bilayer הוא photobleached עם כוח לייזר גבוה, ואת ההתאוששות של פלואורסצנציה נרשמת. (A) דו-שכבה טובה תמיד מתאוששת מהר, עם מקדם דיפוזיה צפוי של 1-1.5 מיקרומטר2/שנייה להרכב השומנים המשמש במקרה זה. (B) דו-חיים רעים מתאוששים לאט מאוד או לא מתאוששים כלל. (C) תמונות מייצגות של דו-שכבתיות רעות: (C-i) דו-שכבה עם חורים, (C-ii) דו-שכבתית עם כתמי שומנים גדולים וחסרי תנועה, ו-(C-iii) דו-שכבתית עם נקודות קטנות וחסרות תנועה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 4: סכמטי המראה כיצד לבצע פולימריזציה של אקטין באמצעות שיטת מאגר המטרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 5: ארגון מרחבי של HYE לאחר קשירה ל-F-אקטין. תמונות TIRF המציגות את הארגון המרחבי של HYE לפני ואחרי הוספת חוטי אקטין (מסומנים ב- Atto-635 maleimide). ארגון HYE הוא הומוגני לפני הוספת F-actin והופך להיות colocalized ו coaligned לאורך חוטי אקטין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. 3. ניתוח נתונים באמצעות תוכנת פיג’י (https://imagej.net), הפחת את הרקע מתמונות החלבון המקשר (משלב 2.4.). מדוד את ערכי העוצמה הממוצעת מהכתם המולבן ומאזור ייחוס. נרמל את עקבות הזמן מהכתם המולבן ומאזור הייחוס לעוצמת ערכי עוצמת ההלבנה שלהם לפני ההלבנה. חלק כל נקודת זמן בערכי האזור המולבן המנורמל בנקודות הזמן המתאימות במעקב הזמן של אזור הייחוס המנורמל. תקן את עקבות הזמן המנורמל המתקבל עבור הרקע ועבור כל תנודות שיטתיות בעוצמה במהלך הרכישה (photobleaching גלובלי, z-drift, וכו ‘).השתמש בשיטה ידנית נטולת התאמה28 כדי להעריך את מקדם הדיפוזיה של החלבונים הדו-שכבתיים הקשורים. בקצרה, ניתן לחשב את מחצית הזמן של פרופיל ההתאוששות, τ1/2, על ידי התבוננות בזמן שבו פרופיל ההתאוששות המנורמל מגיע למחצית ממצבו היציב:כאן, F 0 הוא העוצמה הממוצעת באזור ההלבנה במסגרת הראשונה לאחר ההלבנה, ו- F∞ הוא ערך המצב היציב לטווח הארוך של התאוששות הדו-שכבתי. הערך את רדיוס האקונומיקה האפקטיבי, re, פרמטר המתקן דיפוזיה במהלך הלבנת פוטו, מסריקת קו של פרופיל כתם הלבנה שלאחר הלבנה29. חצי הרוחב במחצית המינימום של סריקת קו זו העוברת במרכז כתם האקונומיקה, r 1/2, מתייחסת ל- re באופן הבא:τ1/2 המחושב בשלב 2.8.3., r e מחושב בשלב 2.8.4., ורדיוס האקונומיקה שנקבע במקור, rn, משמשים לחישוב מקדם הדיפוזיה (D) באמצעות הנוסחה הבאה: ניתוח תמונה של אסטרים אקטומיוסיןבאמצעות פיג’י, הפחת את הרקע מכל התמונות המוקלטות בכל הערוצים. תקן את התמונות לכל תבנית תאורה או הפרעה שאינה אחידה באמצעות תיקון שדה שטוח.הערה: ניתן להשתמש בשקופיות פלסטיק צבעוניות, שהן דוגמאות שטוחות טובות לביצוע תיקונים כאלה. עבור חלבון המקשר וחוטי האקטין על דו-שכבה מישורית, ניתן גם להשתמש בהקרנה הממוצעת של תמונות קדם-מיוזין מרובות כדי ליצור מפות תיקון תאורה ספציפיות לערוץ.עבור ערוץ HYE, המוצג כאן, צלם הקרנה בעוצמה ממוצעת של תמונות HYE מרובות (שנרשמו מאזורים שונים של דו-שכבת השומנים לפני תוספת מיוזין). החל מסנן גאוס מתאים (σ = 50 פיקסלים עד 80 פיקסלים) על ההקרנה הממוצעת (מתמונות טרום-מיוזין או מכל דגימה שטוחה סטנדרטית). המירו את התמונה המסוננת לתמונה של 32 סיביות. חלקו את כל ערכי הפיקסלים בממוצע של התמונה כולה. זה ייתן מפת תיקון מנורמלת עבור ערוץ HYE. חלק את כל התמונות בערוץ HYE עם מפה זו לתיקון שדה שטוח. צור מפות תיקון לערוצים אחרים תוך שימוש באותה אסטרטגיה. נכון להלבנת תמונות בשיטת יחס מעריכית או פשוטה (בהתאם לפרופיל דעיכת העוצמה) בפיג’י.כדי לתקן כל אי-התאמה זמנית של x-y (תנועה תרגומית), מזג את כל הערוצים שתוקנו על-ידי Photobleach ל-Hyperstack יחיד. באמצעות תוסף Hyperstack-Reg בפיג’י, החל גוף קשיח או טרנספורמציית תרגום. לבסוף, פצל את Hyperstack מיושר לערוצים בודדים ושמור אותם בנפרד כערימות TIFF של 16 סיביות לניתוח נוסף.