Rekonstitution membrangebundener minimaler Aktinkortices auf gestützten Lipiddoppelschichten

1. Reagenzien und Ausrüstung Bereiten Sie neue Puffer vor, wie in Tabelle 1 aufgeführt. Verwenden Sie hochreines, entionisiertes Wasser mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 MΩ·cm bei 25 °C. Sterilisieren Sie alle Puffer, indem Sie sie unter Vakuum durch 0,22-μm-Filter leiten. Entgasen Sie die für die Säulenchromatographie verwendeten Puffer. Reinigen Sie das Aktin der Skelettmuskulatur wie zuvor beschrieben18,19. Fügen Sie 20% Glycerin zur endgültigen gereinigten G-Aktinlösung hinzu und machen Sie Aliquots von 500 μL (für Markierungs- oder Massenexperimente) und 10 μL (für Einzelexperimente) Volumen. Die Aliquots werden durch Eintauchen der Röhrchen in flüssigen Stickstoff für 30 s schockgefroren und anschließend bis zu 18 Monate bei −80 °C gelagert.HINWEIS: Alternativ kann gereinigtes Aktin- oder Acetonpulver im Handel erworben werden. Markieren Sie gereinigte Skelettmuskel-G-Aktin mit fluoreszierenden Maleimidfarbstoffen wie zuvor beschrieben5. Bestimmung der Konzentration und des Markierungsgrades des Proteins durch Spektrophotometrie unter Verwendung von korrigiertem A290nm für Aktin (εactin = 26.600 M-1 cm-1) und Aλmax des Farbstoffs. Aliquots von 10 μL herstellen und schockgefrieren, indem Sie die Röhrchen 30 s lang in flüssigen Stickstoff tauchen und bis zu 18 Monate bei −80 °C lagern.HINWEIS: Die Markierung mit lysinkonjugierenden NHS-Estern erzeugt nicht-funktionelles Aktin und sollte vermieden werden. Reinigen Sie die Skelettmuskulatur Myosin II, indem Sie das Protokoll20 befolgen. Führen Sie SDS-PAGE mit 10% Polyacrylamid-Gel gefolgt von Coomassie-Färbung aus, um den Reinheitsgrad des Proteins21 zu bestimmen. Lagern Sie gereinigte Skelettmuskulatur Myosin-II bei −20 °C in flüssiger Form in Myosin II Puffer mit 50% Glycerin.HINWEIS: Das gespeicherte Myosin II kann bis zu 2 Jahre verwendet werden. Markieren Sie gereinigtes Myosin-II mit fluoreszierenden Maleimidfarbstoffen wie zuvor beschrieben5. Vermeiden Sie die Kennzeichnung von Myosinmotoren mit NHS-Esterfarbstoffen. Die Konzentration und der Grad der Markierung werden durch Spektrophotometrie unter Verwendung von korrigiertem A280nm Myosin II und Aλmax des Farbstoffs bestimmt. Das recycelte Myosin II (dunkel oder etikettiert) bei 4 °C lagern und innerhalb von 6 Wochen aufbrauchen. Reinigung von Capping-ProteinErhalten Sie murines Capping-Protein, indem Sie einem früheren Protokoll22 folgen. Führen Sie SDS-PAGE mit 10% Polyacrylamid-Gel gefolgt von Coomassie-Färbung aus, um den Reinheitsgrad des Proteins zu bestimmen. Messen Sie die Konzentration mit A280nm Capping-Protein (εCP = 99.530 M-1 cm-1). Fügen Sie 20% Glycerin zur Proteinlösung hinzu und stellen Sie 5 μL Aliquots in 200 μL PCR-Röhrchen her. Tauchen Sie die Röhrchen in flüssigen Stickstoff und lagern Sie sie bis zu 2 Jahre bei −80 °C.HINWEIS: Die Capping-Proteinaktivität wird durch Polymerisation fester Mengen an fluoreszierendem G-Aktin in Gegenwart unterschiedlicher Capping-Proteinmengen überprüft. Die Filamente werden dann unter einem Mikroskop abgebildet und ihre Längenverteilung quantifiziert. Je höher die relative Konzentration des Capping-Proteins ist, desto kürzer sind die Aktinfilamentverteilungen. Siehe Köster et al.5. Exprimieren Sie ein fluoreszierendes Membran-Aktin-Linkerprotein, z. B. verwenden Sie für dieses Protokoll 10xHis-YFP-EzrinABD (HYE), exprimieren Sie es in Bl21DE3* Escherichia Coli und reinigen Sie es wie zuvor beschrieben23. Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins durch Spektrophotometrie. Lagern Sie das Protein in kleinen Aliquots in einem Gelfiltrationschromatographiepuffer (oder einem anderen geeigneten Puffer) mit 20% Glycerin bei −80 °C. Unter diesen Bedingungen ist das Protein über 2 Jahre stabil.HINWEIS: Die Wahl des Aktin-Membran-Linkerproteins und des Fluoreszenzmarkers hängt von der Art der Frage ab, die man behandelt. In den letzten Jahren wurde eine breite Palette von Lipidbindungsstrategien entwickelt, darunter Histidin-markierte Proteine24, Biotin-Streptavidin 25 und einzelsträngige DNA26. Herstellung von mehrschichtigen Vesikeln (MLVs)HINWEIS: Der Workflow von MLVs zu unterstützten Lipiddoppelschichten ist in Abbildung 2 dargestellt.5-10 Durchstechflaschen aus gelbem Glas in ein 200-ml-Glasbecherglas geben. Füllen Sie das Becherglas mit 2% iger Reinigungslösung, gerade genug, um die Glasfläschchen unter Wasser zu tauchen. Beschallen Sie sie in einem Wasserbad für 30 min bei vollem Puls und 65 °C. Nehmen Sie die Durchstechflaschen aus der Lösung heraus und spülen Sie sie gründlich mit destilliertem Wasser ab. Die Durchstechflaschen in ein Glasbecherglas mit 2 N NaOH geben und 20 min lang beschallen. Während dieses Schritts ist keine Heizung erforderlich. Nehmen Sie die Durchstechflaschen aus der NaOH-Lösung heraus und spülen Sie sie gründlich mit destilliertem Wasser ab. Trocknen Sie die Durchstechflaschen in einem Heißluftofen bei 65 °C für 2 h oder länger. Bewahren Sie die gereinigten Durchstechflaschen bis zu 6 Wochen in einem sauberen Becherglas auf, das mit transparenter Folie verschlossen ist.VORSICHT: Führen Sie die folgenden Schritte in einem chemischen Abzug durch. Behandeln Sie Chloroform und die Lipidlösungen mit gasdichten Hamilton-Glasspritzen, um eine Kontamination durch Kunststoff zu vermeiden. Spülen Sie die Hamilton-Spritzen und einige braune Glasdurchstechflaschen mehrmals mit reinem Chloroform ab. Nehmen Sie das in Glasampullen gelagerte Lipidpulver aus dem Gefrierschrank -20 °C und fügen Sie ausreichende Mengen Chloroform hinzu, um die Lipidpulver auf Konzentrationen von 10-25 mg/ml aufzulösen. Die Lösung aus der Ampulle in eine frisch gereinigte Durchstechflasche aus Braunglas geben und entsprechend beschriften. Führen Sie diesen Schritt auf Eis durch, um die Verdunstung von Chloroform zu reduzieren. Stellen Sie eine DOPC-Stammlösung mit einer Konzentration von 10-25 mg/ml und DGS-NTA-Ni2+ mit einer Konzentration von 1-10 mg/ml her. Um eine funktionierende Lipidmischung herzustellen, nehmen Sie eine saubere Glasdurchstechflasche und spülen Sie sie 2x mit Chloroform ab. Geben Sie 300 μL reines Chloroform in die Durchstechflasche, um als Basis für eine bessere Mischung der Komponenten zu dienen. Dies hat keinen Einfluss auf die Endkonzentrationen der Lipide, da das gesamte Chloroform in den nächsten Schritten ausgetrocknet wird. Fügen Sie der Durchstechflasche gemessene Mengen an Stammlipidlösungen hinzu, um die gewünschten Arbeitslipidmischungen herzustellen. Die Ziellipidkonzentration im Lipidrehydratationspuffer beträgt 4 mM. Trocknen Sie das Lipidgemisch unter einem langsamen Strom vonN2-Gas in der chemischen Haube bei Raumtemperatur. Dieser Schritt kann bis zu 30 Minuten für jede Durchstechflasche dauern. Nachdem das gesamte Lösungsmittel ausgetrocknet ist, vakuum-austrocknen Sie den Lipidfilm für >2 h bei Raumtemperatur, um alle Spuren von Chloroform zu entfernen. Resuspendieren Sie die getrocknete Lipidmischung in einem Lipidrehydratationspuffer für eine endgültige Lipidkonzentration von 4 mM. Inkubieren Sie für 5-10 min, um eine Rehydratation der Lipide zu ermöglichen. Wirbeln Sie die Lipidlösung für etwa 30 s, um MLVs zu bilden. Machen Sie 0,5-1 ml Aliquots der MLVs in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Die Röhrchen in flüssigen Stickstoff tauchen, mit einer transparenten Folie verschließen und bei −20 °C lagern (bis zu 6 Wochen).HINWEIS: Die Lipidkonzentrationen werden so gewählt, dass ausreichend große Volumina möglich sind, die ein zuverlässiges Pipettieren mit den Hamilton-Spritzen ermöglichen. Wenn die zur Herstellung der Brühe erforderlichen Volumina zu groß sind, um das getrocknete Lipidpulver aufzulösen, nehmen Sie mehrere Verdünnungen der Brühe vor, um eine reproduzierbare Mischung verschiedener Lipide zu gewährleisten. Herstellung von kleinen unilamellaren Vesikeln (SUVs)Nehmen Sie ein Aliquot MLVs aus dem Speicher von −20 °C heraus und tauen Sie es bei Raumtemperatur auf. Die Vesikel durch Eintauchen des Mikrozentrifugenröhrchens in flüssigen Stickstoff für 15-30 s schockieren und sofort in ein auf 45 °C eingestelltes Wasserbad geben, bis die Lösung vollständig aufgetaut ist (1-2 min). Wiederholen Sie den obigen Gefrier-Tau-Zyklus 10x-15x, bis die Lösung weniger trüb aussieht.HINWEIS: Stellen Sie die Temperatur des Wasserbades höher ein als die Übergangstemperatur der aufzutauenden Lipidmischung, um eine gleichmäßige Lipidmischung zu ermöglichen. Equilibrieren Sie einen spritzenbasierten Mini-Extruder, der mit einer 80-nm-Polycarbonat-Filtermembran mit SUV-Rehydratationspuffer ausgestattet ist. Stellen Sie sicher, dass das System keine Leckagen oder Blasen aufweist. Während das Extrusionsverfahren monodisperse SUVs mit minimaler Lipidschädigung ergibt, können Lipidmischungen mit negativer Ladung an der Polycarbonatmembran haften. Führen Sie die aufgetaute Lipidlösung vorsichtig durch den voräquilibrierten Extruder von einer Seite zur anderen und dann zurück. Wiederholen Sie den Zyklus 5x-10x, bis die Lipidlösung sichtbar klar wird, was auf die Bildung von SUVs mit ~100 nm Durchmesser hinweist. Zentrifugieren Sie die extrudierte Suspension (oder beschallen Sie die Lösung; siehe Hinweis unten) bei 15.000 x g für 60 min bei 4 °C, um die Lipidablagerungen abzuspritzen. Sammeln Sie die oberen 80% der Lösung, ohne das Pellet zu stören und ohne Blasen zu erzeugen. Der Überstand mit den SUVs wird in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bis zu 6 Tage auf Eis gelagert.HINWEIS: Eine Alternative zur Zentrifugation ist die Spitzenbeschallung, die wie folgt durchgeführt wird. Schalten Sie einen Mikrospitzen-Ultraschallgerät ein und stellen Sie die folgenden Einstellungen ein: Amplitude = 30% des Maximums, EINSCHALTZEIT = 10 s, AUS-Zeit = 60 s. Reinigen Sie die Spitze des Mikrobeschallers mit entionisiertem Wasser, gefolgt von 2 N NaOH, Chloroform und erneut entionisiertem Wasser. Tauchen Sie die Ultraschallspitze in jede dieser Lösungen und beschallen Sie sie für 1-2 Zyklen mit den obigen Einstellungen. Tauchen Sie die saubere Spitze in die gefrieraufgetaute Vesikellösung und beschallen Sie sie für 3-6 Zyklen auf Eis, bis die Lösung klar wird. Überprüfen Sie nach der Zentrifugation auf Anzeichen eines hohen Lipidabbaus oder einer fehlgeschlagenen Lipidextrusion wie die Bildung eines dünnen weißlichen Films und/oder eines deutlich sichtbaren Pellets. Fahren Sie in diesen Fällen nicht fort und wiederholen Sie die SUV-Vorbereitungsschritte erneut.HINWEIS: Die Haltbarkeit von SUVs kann für verschiedene Lipidgemische unterschiedlich sein. SUVs aus DOPC: DGS-NTA-Ni2+ sind für diese Experimente bis zu 6 Tage stabil. Tipps zur Behebung häufig auftretender Probleme finden Sie in Tabelle 2. Abbildung 2: Schematische Darstellung des Workflows von der Herstellung mehrschaliger Vesikel und kleiner unilamellärer Vesikel bis zur Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten. Erstellt mit Biorender. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 2. Rekonstitution membrangebundener Aktinnetzwerke Vorbereitung von ProbenkammernNehmen Sie 3-5 rechteckige Glasdeckgläser und legen Sie sie in ein Coplin-Glas. Schalten Sie den Badsonikator ein und stellen Sie die Temperatur auf 65 °C ein. Füllen Sie das Coplin-Glas mit 2% iger Reinigungslösung, um die Deckgläser vollständig einzutauchen, und legen Sie es für 30 Minuten im vollen Pulsmodus in den Sonicator. Verwenden Sie eine stumpfe PTFE-beschichtete Pinzette, um die Deckgläser nacheinander aus dem Glas zu nehmen. Spülen Sie sie gründlich mit destilliertem Wasser ab und stellen Sie sie in ein anderes Coplin-Glas, das mit 2 N NaOH gefüllt ist. Beschallen Sie die Deckgläser für 20 Minuten im vollen Pulsmodus. Entfernen Sie die Deckgläser nacheinander, spülen Sie sie gründlich mit destilliertem Wasser ab und stellen Sie sie in ein anderes Coplin-Glas, das mit destilliertem Wasser gefüllt ist.HINWEIS: Optional die Deckgläser 20 min in destilliertem Wasser beschallen und dann erneut mit destilliertem Wasser abspülen. Nehmen Sie unmittelbar vor Beginn des Versuchs das Glas mit den Deckgläsern in eine chemische Haube, die mit einerN2-Gaszufuhr ausgestattet ist. Optimieren Sie den Luftdruck desN2-Gasstroms durch Versuch und Irrtum, so dass er gerade ausreicht, um Wasser von der Deckglasoberfläche zu verdrängen, ohne sie zu brechen. Richten Sie den Gasstrom N2 parallel zur Deckglasebene aus, um die Möglichkeit eines Bruchs des Deckglases zu verringern. Verwenden Sie Handschuhe und Pinzetten, um die Deckgläser nacheinander aus dem Glas zu nehmen, um sie unter dem Strom N2 zu trocknen. Trocknen Sie beide Seiten jedes Deckglases und legen Sie sie auf ein sauberes Kunststoffgitter mit einem Deckel. Legen Sie die Box mit den Deckgläsern in einen Exsikkator, um den Kontakt mit Staubpartikeln in der Luft zu vermeiden.HINWEIS: Die N 2-getrockneten Deckgläser können in einem Exsikkator gelagert werden, wo sie bis zu2 Tage hydrophil bleiben können. Diese Strategie kann nützlich sein, wenn viele Doppelschichten für das Experiment benötigt werden oder wenn das Experiment länger als 8 Stunden dauert. Nehmen Sie autoklavierte PCR-Röhrchen und schneiden Sie ihre Lider und unteren konischen Hälften mit einer scharfen chirurgischen Klinge aus. Nehmen Sie die zylindrischen halbgeschnittenen Tuben nacheinander, tragen Sie UV-härtenden Klebstoff auf den glatten Rand jedes geschnittenen Röhrchens auf und legen Sie ihn umgekehrt auf ein frisch gereinigtes Deckglas, so dass der Rand flach auf dem Deckglas sitzt. Bewegen Sie den Zylinder nicht seitlich, sobald er auf dem Deckglas positioniert ist, um sicherzustellen, dass der Klebstoff nicht in den zentralen Raum der Kammer verschüttet wird. Rechteckige Deckgläser können bequem bis zu drei Reaktionskammern aufnehmen, und die runden können nur eine in der Mitte aufnehmen (Abbildung 1). Legen Sie die kammerführenden Deckgläser in einen UV-Ozonreiniger mitO2-Versorgung und Vakuum (oder verwenden Sie einen UV-Strahler). Schalten Sie das UV-Licht ein und leuchten Sie für 3-5 Minuten, damit der Klebstoff polymerisieren kann. Führen Sie eine längere Beleuchtung durch (10-15 min), um die Hydrophilie des Deckglases und damit die Qualität der Lipiddoppelschicht zu verbessern. Lagern Sie die trockenen, UV-beleuchteten Probenkammern bis zu 8 h in kleinen Kunststoffboxen (z. B. leere rechteckige Deckglasboxen), die in transparente Folie eingewickelt sind, um den Kontakt mit Staubpartikeln in der Luft zu reduzieren.HINWEIS: Ein stetiger Strom vonO2 in Gegenwart von UV-Licht bildet Ozon- und Sauerstoffradikale, die organische Verunreinigungen von der Oberfläche des Deckglases entfernen können. Ein Vakuum verhindert das Austreten von giftigem Ozon, das während des Prozesses gebildet wird. Nehmen Sie die Deckgläser heraus und testen Sie die Kammern auf Leckagen, indem Sie sie mit destilliertem Wasser auffüllen. Jede Kammer kann bis zu ~150 μL Probe aufnehmen. Entsorgen Sie die undichten Kammern.HINWEIS: Eine weitere großartige und sichere Reinigungsoption ist der Plasmareiniger. Die Zeit- und Leistungseinstellungen hängen vom Modell ab, aber achten Sie darauf, die Glasobjektträger nicht mit Plasma zu überbehandeln, da dies zu einer Verringerung der Lipidbeweglichkeit führt. Die Oberflächenbehandlung kann die Beweglichkeit der Lipide27 beeinträchtigen, wie bei längerer Behandlung mit der Reinigungslösung (>45 min) oder NaOH (>30 min) beobachtet wurde. Herstellung von unterstützten LipiddoppelschichtenWaschen Sie jede Kammer mit SLB-Formationspuffer (oder 1x PBS), um Oberflächenverunreinigungen zu entfernen, wobei am Ende 100 μL Puffer übrig bleiben. Markieren Sie den Füllstand des Puffers bei 100 μL mit einem permanenten Marker, um Änderungen im Volumen reproduzierbar zu verfolgen. 2 μL 0,1 MCaCl2 in die Kammer geben. Dies verbessert die Adsorption der Vesikel an die Glasoberfläche und verstärkt im nächsten Schritt die Doppelschichtbildung. 8 μL der SUV-Lösung (ab Schritt 1.10) in jede Kammer geben und 15 min bei 25 °C inkubieren.HINWEIS: Das Volumen der hinzuzufügenden SUV-Mischung kann geschätzt werden, indem die Gesamtzahl der Lipide (mit einer durchschnittlichen Fläche von 0,72 nm2) berechnet wird, die benötigt werden, um den exponierten hydrophilen Bereich des Bohrlochs vollständig mit zwei Lipidschichten abzudecken. Die ungebundenen Vesikel mit Aktinmotilitätspuffer (1x KMEH) abwaschen. Entfernen Sie zunächst 50 μL des SLB-Formationspuffers, so dass nur 50 μL in der Probenkammer verbleiben. Zweitens fügen Sie 100 μL 1x KMEH in die Kammer hinzu. Mischen Sie vorsichtig und entfernen Sie dann 100 μL des Puffers, ohne den Boden zu berühren.HINWEIS: Es ist wichtig, beim Waschen sanft zu sein. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze den Boden der Kammer nicht berührt. Halten Sie die Pipette geneigt, um den Pufferfluss an die Wand der Kammer und nicht direkt an die Doppelschicht zu lenken, da ein direkter Fluss die Doppelschicht stören kann. Achten Sie darauf, beim Pipettieren keine Luftblasen einzuführen, da Luft die Lipiddoppelschicht erreichen und Defekte verursachen kann. Wiederholen Sie die Waschgänge 10x, indem Sie 100 μL 1x KMEH hinzufügen und 100 μL entfernen. 10 μL 1 mg/ml β-Casein in die Doppelschicht geben, vorsichtig mischen und 5-10 min inkubieren. β-Casein blockiert die Bereiche auf dem Deckglas, an denen sich die Doppelschicht nicht gebildet hat. Waschen Sie β-Casein 3x mit 1x KMEH ab, wie in Schritt 2.2.3 beschrieben. und bringen Sie den Puffer wieder auf die 100-μL-Marke. Zugabe von Membran-Aktin-LinkerNehmen Sie während der β-Casein-Inkubation (Schritt 2.2.5.) ein Aliquot Membran-Aktin-Linkerprotein aus −80 °C, tauen Sie es schnell bei 37 °C auf und halten Sie es dann auf Eis. Das Aliquot wird mit einem Proteinverdünnungspuffer auf eine Konzentration von 1 μM verdünnt. Fügen Sie das Linkerprotein in einer definierten Endkonzentration (typischerweise 5-20 nM) hinzu und mischen Sie vorsichtig. Um ein schnelles Gleichgewicht des Proteins in der Kammer zu gewährleisten, fügen Sie Volumina hinzu, die größer als 20 μL sind, indem Sie das Linkerprotein mit 1x KMEH vormischen. 40 min bei Raumtemperatur inkubieren. 3x mit 1x KMEH-Puffer waschen, um das ungebundene HSE-Protein zu entfernen (wie in Schritt 2.2.3.). Bringen Sie den Pufferstand in jeder Kammer wieder auf die 100-μL-Marke. Die Probe ist nun bereit für die Bildgebung. Qualitätsbeurteilung der LipiddoppelschichtHINWEIS: Dies ist ein optionaler Schritt, der nicht jedes Mal ausgeführt werden muss. Wir empfehlen, diese Bewertung jedes Mal durchzuführen, wenn frische SUVs aus gefrorenen MLV-Beständen hergestellt werden.Schalten Sie das Mikroskop, die Anregungslaser und die Detektionskameras ein. Stellen Sie sicher, dass der Laser ausgerichtet ist, das Objektiv gereinigt ist und die Software bereit ist, Bilder aufzunehmen. Öl auf das 100-fache Objektiv geben, die Probe auf den Mikroskoptisch montieren und das Objektiv auf die Doppelschicht fokussieren. Stellen Sie sicher, dass die Laserposition so ist, dass sie eine vollständige interne Reflexion auf der Probe erfährt. Verwenden Sie einen 488 nm Anregungslaser, um die Fluoreszenzintensitätsverteilung des doppelschichtgebundenen 10xHis-YFP-EzrinABD zu überprüfen.HINWEIS: Doppelschichten von guter Qualität zeigen eine großräumige, gleichmäßige Verteilung der Fluoreszenzintensität. Schlechte Doppelschichten zeigen intensive und fleckige fluoreszierende Flecken. Um die Integrität der Doppelschicht zu bestimmen, führen Sie einen FRAP-Test durch.Wählen Sie einen Bereich von Interesse auf der Doppelschicht und zeichnen Sie einige Bilder des Sichtfelds unter Verwendung von Bildbedingungen auf, die ein Signal-Rausch-Verhältnis von 5:1 oder höher bieten. Pausieren Sie die Aufnahme und schließen Sie die Feldmembran des TIRF-Mikroskops, um einen konzentrierten Laserstrahl auf einen kleinen kreisförmigen Bereich der Doppelschicht zu fokussieren, um die Fluorophore lokal zu bleichen. Schalten Sie den Laser auf seine maximale Leistung ein, um den kleinen Bereich für 3-10 s zu photobleichen, und schalten Sie dann den Laser aus. Öffnen Sie die Feldblende wieder auf ihren ursprünglichen Radius, stellen Sie den Bildgebungszustand wieder auf die Einstellungen (vor dem Bleichmittel) ein und setzen Sie sofort die Aufzeichnung der Wiederherstellung des Fluoreszenzsignals im Sichtfeld fort. Überprüfen Sie, ob die Doppelschicht flüssig ist. Gute Doppelschichten mit normaler lateraler Diffusion erholen sich schnell, während sich schlechte Doppelschichten langsam oder gar nicht erholen (Abbildung 3). Wenn der Bilayer nicht wiederhergestellt wird, überprüfen Sie den Abschnitt zur Fehlerbehebung und starten Sie ihn neu. Speichern Sie die Bilder als 16-Bit-TIFF-Dateien. Für eine quantitative Schätzung des Diffusionskoeffizienten ist Schritt 3 zu prüfen. unter. Polymerisation von fluoreszierendem AktinHINWEIS: Um Zeit zu sparen, beginnen Sie mit der Polymerisation von Aktin während der Inkubationszeit des HSE-Proteins, das an die Doppelschicht bindet (Schritt 2.3.) oder während der Qualitätsbewertung der Doppelschicht (Schritt 2.4.).Mischen Sie unmarkiertes und fluoreszierend markiertes G-Aktin in einem Molverhältnis von 10:1 und füllen Sie es mit G-Buffer auf, so dass die Konzentration von G-Aktin 20 μM beträgt. Die Konzentration, bei der Aktin schließlich polymerisiert wird, beträgt 1/4 dieses Wertes. 1/10 von 10x ME Puffer zu der Mischung für eine 1x Lösung geben und 2 min inkubieren. In diesem Schritt werden die an G-Aktin gebundenenCa2 +-Ionen durchMg2+ -Ionen ersetzt. Stellen Sie sicher, dass das Endvolumen ein Vielfaches von 10 μL aufweist. Fügen Sie die gewünschte Menge an Capping-Protein wie folgt hinzu. Eine Durchstechflasche mit verschließender Proteinbrühe schnell bei 37 °C auftauen und dann auf Eis halten. Mit G-Puffer so verdünnen, dass die Konzentration des Capping-Proteins nun doppelt so hoch ist wie die gewünschte Endkonzentration in der Polymerisationsmischung. Geben Sie der Aktinmischung aus Schritt 2.5.1 ein gleiches Volumen der verdünnten Verschließproteinlösung hinzu. Zum Schluss fügen Sie der Reaktionsmischung ein gleiches Volumen an frischem 2x-Zielpuffer hinzu. Das Endvolumen der Lösung sollte das Vierfache des Volumens der Aktinmischung am Ende von Schritt 2.5.2 betragen. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration von KMEH 1x, von ATP 1 mM, von BSA 1 mg / ml und von G-Aktin 5 μM beträgt.Im Dunkeln bei 25 °C für 45-60 min inkubieren, damit die Polymerisation stattfinden kann.HINWEIS: Dies wird als Zielpufferstrategie bezeichnet, bei der ein Volumen Mg 2+ G-Aktin (Schritt 2.5.1.) mit einem Volumen Capping-Proteinmix (Schritt 2.5.2.) und zwei Volumen2x Zielpuffer (Schritt 2.5.3.) gemischt wird. Dies erleichtert es, die Menge an Aktin nach oben oder unten zu skalieren und die relative Konzentration des Capping-Proteins (oder eines anderen Aktinmodulators; Abbildung 4). Zugabe von fluoreszierenden AktinfilamentenSchneiden Sie einige 200-μL-Spitzen mit einer scharfen Klinge oder einer Schere ab, um sie stumpf zu machen. Das erforderliche Volumen an 5 μM polymerisiertem Aktin (ab Schritt 2.5.3.) wird vorsichtig mit einer stumpfen Pipettenspitze (um ein Scheren von Aktinfilamenten zu verhindern) pipettiert und in ein sauberes autoklaviertes PCR-Röhrchen gegeben. Geben Sie 1x KMEH in das Röhrchen, um das Volumen >20 μL zu machen, und mischen Sie vorsichtig, um ein Scheren von F-Aktin zu vermeiden. Entfernen Sie aus der montierten Probenkammer ein gleiches Volumen des Puffers. Geben Sie die polymerisierte Aktinlösung in die Kammer und pipettieren Sie vorsichtig 3x auf und ab, ohne die Doppelschicht am Boden zu berühren. Dadurch können sich Aktinfilamente gleichmäßig auf der Doppelschicht verteilen. Montieren Sie die Probe auf dem TIRF-Mikroskop (siehe Schritt 2.4.1. und Schritt 2.4.2.). Man kann den Prozess der F-Aktin-Bindung an die Doppelschicht aufzeichnen. Inkubieren für 20-30 min. Nehmen Sie einige Bilder aus verschiedenen Sichtfeldern auf, nachdem F-Actin zusätzlich einen stabilen Zustand erreicht hat. Beobachten Sie Veränderungen in der räumlichen Organisation von 10xHis-YFP-EzrinABD vor (homogen) und nach Aktinorganisation.HINWEIS: HYE wird in Abwesenheit von Aktin gleichmäßig über die Lipiddoppelschicht verteilt. Bei Zugabe von Aktinfilamenten kolokalisiert HYE mit F-Aktin. Das Ausmaß der Kolokalisation hängt von der Aktinbindungsaffinität des Linkerproteins ab; Je stärker die Affinität, desto höher die Kolokalisation und desto langsamer die laterale Beweglichkeit des Linkerproteins (Abbildung 5). Zugabe von Myosin IINach 30 Minuten Aktininkubation montieren Sie die Probe wieder auf das Mikroskop (wenn es nicht montiert wurde). Überprüfen Sie das Signal in den Linkerprotein- und F-Aktin-Kanälen. Passen Sie die Bildgebungsbedingungen bei Bedarf an. Wählen Sie eine gute Region mit gleichmäßigem Linkerproteinsignal und gleichmäßig gestreuten Aktinfilamenten und ohne Artefakte für eine lange Zeitrafferaufnahme. Nehmen Sie 10-15 Bilder bei 0,1-0,2 Hz vor Myosin auf und pausieren Sie die Aufnahme. Pipettieren Sie das erforderliche Volumen an recyceltem Muskelmyosin-II aus der Durchstechflasche mit einer stumpfen Pipettenspitze (um das Scheren von Myosinfilamenten zu verhindern) und fügen Sie es einem sauberen autoklavierten PCR-Röhrchen hinzu. Sofort 1x KMEH in die Tube geben, um das Volumen >20 μL zu machen und vorsichtig zu mischen. Man kann auch ATP, ATP-Regenerationsmischung, Photostabilisierungsmittel usw. hinzufügen. während dieses Schritts. Entfernen Sie vorsichtig ein gleiches Volumen des Puffers aus der montierten Probenkammer, ohne sie zu stören. Geben Sie die Myosinlösung vorsichtig in die Probenkammer. Pipettieren Sie nicht nach oben und unten, da dies die oberflächengebundenen Filamente stört. Nehmen Sie sofort die Zeitrafferaufnahme wieder auf und beobachten Sie, wie sich das System vom Prä-Myosin-Zustand zu ATP-befeuerten kontraktilen Acto-Myosin-Flüssen und der Asternbildung zu einem ATP-erschöpften gestauten Zustand entwickelt (siehe repräsentative Ergebnisse). Nehmen Sie Hintergrundbilder für alle Kanäle mit einem reinen Puffersample auf. Speichern Sie alle Bilder als 16-Bit-.tiff-Dateien. In Tabelle 2 finden Sie Tipps zum Beheben häufiger Probleme. Abbildung 3: Qualitätsbeurteilung der Doppelschichten mit schnellem FRAP-Assay. Unterstützte Lipiddoppelschichten (SLBs), die aus DOPC- und Ni-NTA-Lipiden (98:2 mol%) hergestellt werden, sind mit HYE (10xHis-YFP-markierter Membran-Aktin-Linker) beschichtet. Nachdem das ungebundene Protein ausgewaschen wurde, wird die fluoreszierende Doppelschicht unter einem TIRF-Mikroskop abgebildet. Ein kleiner Bereich auf der Doppelschicht wird mit hoher Laserleistung photogebleicht und die Erholung der Fluoreszenz aufgezeichnet. (A) Eine gute Doppelschicht erholt sich immer schnell, mit einem erwarteten Diffusionskoeffizienten von 1-1,5 μm2/s für die in diesem Fall verwendete Lipidzusammensetzung. (B) Schlechte Doppelschichten erholen sich sehr langsam oder erholen sich überhaupt nicht. (C) Repräsentative Bilder von schlechten Doppelschichten: (C-i) eine Doppelschicht mit Löchern, (C-ii) eine Doppelschicht mit großen, unbeweglichen Lipidflecken und (C-iii) eine Doppelschicht mit kleinen, unbeweglichen Punkten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 4: Schematische Darstellung der Polymerisation von Aktin mit der Zielpuffermethode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Räumliche Organisation von HYE bei Bindung an F-Aktin. TIRF-Schnappschüsse, die die räumliche Organisation von HYE vor und nach der Zugabe von Aktinfilamenten zeigen (markiert mit Atto-635-Malemid). Die HYE-Organisation ist vor der Zugabe von F-Aktin homogen und wird entlang von Aktinfilamenten kolokalisiert und coaligniert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. 3. Datenanalyse Subtrahieren Sie mit der Fidschi-Software (https://imagej.net) den Hintergrund von den Linkerproteinbildern (ab Schritt 2.4.). Messen Sie die mittleren Intensitätswerte aus dem gebleichten Punkt und einem Referenzbereich. Normalisieren Sie die Zeitspuren vom gebleichten Fleck und dem Referenzbereich auf die Intensität ihrer jeweiligen Intensitätswerte vor dem Bleichmittel. Teilen Sie jeden Zeitpunkt in den normalisierten gebleichten Bereichswerten durch die entsprechenden Zeitpunkte in der normalisierten Zeitablaufverfolgung des Referenzbereichs. Korrigieren Sie die resultierende normalisierte Zeitspur für den Hintergrund und für systematische Intensitätsschwankungen während der Aufnahme (globales Photobleichen, Z-Drift usw.).Verwenden Sie eine anpassungsfreie, manuelle Methode28 , um den Diffusionskoeffizienten der zweischichtigen gebundenen Proteine zu schätzen. Kurz gesagt, die Halbzeit des Wiederherstellungsprofils, τ1/2, kann berechnet werden, indem man den Zeitpunkt betrachtet, zu dem das normalisierte Erholungsprofil die Hälfte seines stationären Zustands erreicht:Hier ist F 0 die mittlere Intensität im gebleichten Bereich im ersten Bild nach dem Photobleaching, und F∞ ist der langfristige stationäre Wert der Erholung der Doppelschicht. Schätzen Sie den effektiven Bleichradius, re, ein Parameter, der die Diffusion während des Photobleichens korrigiert, aus einem Linienscan des Postbleichfleckprofils29. Die halbe Breite mindestens halber Breite dieses Zeilenscans, der durch die Mitte des Bleichflecks verläuft, r 1/2, bezieht sich auf re wie folgt: Das in Schritt 2.8.3 berechnete τ1/2, das in Schritt 2.8.4 berechnete r e und der ursprünglich eingestellte Bleichradius rn werden zur Berechnung des Diffusionskoeffizienten (D) nach folgender Formel verwendet: Bildanalyse von Actomyosin-AsternSubtrahieren Sie mit Fidschi den Hintergrund von allen aufgezeichneten Bildern in allen Kanälen. Korrigieren Sie die Bilder mithilfe der Flat-Field-Korrektur auf ungleichmäßige Beleuchtungs- oder Interferenzmuster.HINWEIS: Man kann farbige Plastikobjektträger verwenden, die gute flache Proben sind, um solche Korrekturen durchzuführen. Für das Linkerprotein und die Aktinfilamente auf einer planaren Doppelschicht kann man auch die durchschnittliche Projektion mehrerer Prä-Myosin-Bilder verwenden, um kanalspezifische Beleuchtungskorrekturkarten zu erstellen.Für den hier gezeigten HYE-Kanal nehmen Sie eine durchschnittliche Intensitätsprojektion mehrerer HYE-Bilder (aufgenommen aus verschiedenen Regionen der Lipiddoppelschicht vor Myosin zusätzlich). Wenden Sie einen geeigneten Gaußfilter (σ = 50 Pixel bis 80 Pixel) auf die durchschnittliche Projektion an (aus Prä-Myosin-Bildern oder einer beliebigen flachen Standardprobe). Konvertieren Sie das gefilterte Bild in ein 32-Bit-Bild. Teilen Sie alle Pixelwerte durch den Mittelwert des gesamten Bildes. Dadurch erhalten Sie eine normalisierte Korrekturkarte für den HYE-Kanal. Teilen Sie alle Bilder im HYE-Kanal mit dieser Karte für die Korrektur des flachen Feldes. Erstellen Sie Korrekturkarten für andere Kanäle mit der gleichen Strategie. Korrekt für Photobleiche mit einer exponentiellen oder einfachen Verhältnismethode (abhängig vom Intensitätszerfallsprofil) in Fidschi.Um eine zeitliche x-y-Fehlausrichtung (translatorische Bewegung) zu korrigieren, führen Sie alle photobleichkorrigierten Kanäle zu einem einzigen Hyperstack zusammen. Wenden Sie mit dem Hyperstack-Reg-Plugin in Fidschi eine Rigid Body oder Translation Transformation an. Schließlich teilen Sie den ausgerichteten Hyperstack in einzelne Kanäle auf und speichern Sie sie separat als 16-Bit-TIFF-Stacks zur weiteren Analyse.