Восстановление мембранно-привязанных минимальных актиновых коры на поддерживаемых липидных бислоях

1. Реагенты и оборудование Подготовьте свежие буферы, как указано в таблице 1. Используйте сверхчистую деионизированную воду с удельным сопротивлением 18,2 МОм·см при 25 °C. Стерилизуйте все буферы, пропуская их через фильтры 0,22 мкм под вакуумом. Дегаз буферов, используемых для колоночной хроматографии. Очищают скелетные мышцы актином, как описано ранее18,19. Добавьте 20% глицерин в конечный очищенный раствор G-актина и сделайте аликвоты объемом 500 мкл (для маркировки или объемных экспериментов) и 10 мкл (для отдельных экспериментов). Вспышка замораживает аликвоты, погружая трубки в жидкий азот на 30 с, а затем храните их при -80 °C до 18 месяцев.ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, очищенный актин или порошок ацетона можно приобрести в коммерческих целях. Метят очищенный G-актин скелетных мышц любыми флуоресцентными малеимидными красителями, как описано ранее5. Определяют концентрацию и степень маркировки белка методом спектрофотометрии с помощью скорректированных А290 нм для актина (εактин = 26 600 М-1 см-1) и Аλmax красителя. Сделайте аликвоты по 10 мкл и заморозьте, окунув трубки в жидкий азот на 30 с и храните при −80 °C до 18 месяцев.ПРИМЕЧАНИЕ: Маркировка лизин-конъюгирующими эфирами NHS создаст нефункциональный актин и ее следует избегать. Очистите миозин скелетных мышц II, следуя протоколу20. Запустите SDS-PAGE с использованием 10% полиакриламидного геля с последующим окрашиванием Coomassie для определения уровня чистоты белка21. Хранить очищенный миозин-II скелетных мышц при −20 °C в жидкой форме в буфере миозина II с 50% глицерином.ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраненный миозин II можно использовать до 2 лет. Метят очищенный миозин-II любыми флуоресцентными малеимидными красителями, как описано ранее5. Избегайте маркировки миозиновых двигателей красителями NHS-эфиров. Определяют концентрацию и степень маркировки методом спектрофотометрии с помощью скорректированных А280 нм миозина II и Аλmax красителя. Храните переработанный миозин II (темный или меченый) при 4 °C и используйте в течение 6 недель. Очистка укупорочного белкаПолучите мышиный укупоривающий белок, следуя более раннему протоколу22. Запустите SDS-PAGE с использованием 10% полиакриламидного геля с последующим окрашиванием Coomassie для определения уровня чистоты белка. Измерьте концентрацию, используя280 нм белка укупорки (εCP = 99 530 M-1 см-1). Добавьте 20% глицерин в белковый раствор и сделайте 5 мкл аликвот в 200 мкл ПЦР-пробирках. Погрузите трубки в жидкий азот и храните их при температуре −80 °C до 2 лет.ПРИМЕЧАНИЕ: Укупорочная активность белка проверяется путем полимеризации фиксированных количеств флуоресцентного G-актина в присутствии различных количеств белка. Затем нити визуализируются под микроскопом, и их распределение по длине количественно определяется. Чем выше относительная концентрация белка, тем короче распределение актиновой нити. Köster et al.5. Экспрессируют флуоресцентный мембранно-актиновый линкерный белок, например, для этого протокола используют 10xHis-YFP-EzrinABD (HYE), экспрессируют его в Bl21DE3* Escherichia Coli и очищают, как описано ранее23. Определяют концентрацию белка методом спектрофотометрии. Хранить белок в небольших аликвотах в гелефильтрационном хроматографическом буфере (или любом другом соответствующем буфере) с 20% глицерином при −80 °C. В этих условиях белок стабилен более 2 лет.ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор актин-мембранного линкера белка и флуоресцентного маркера зависит от типа вопроса, к которому мы обращаемся. В последние годы был разработан широкий спектр липидсвязывающих стратегий, включая помеченные гистидином белки24, биотин-стрептавидин25 и одноцепочечную ДНК26. Подготовка многоламеллярных везикул (MLV)ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс от MLV к поддерживаемым липидным бислоям показан на рисунке 2.Поместите 5-10 флаконов из янтарного стекла в стеклянный стакан объемом 200 мл. Наполните стакан 2% раствором для очистки, достаточно просто погрузить стеклянные флаконы. Настаивайте их на водяной бане в течение 30 мин при полном импульсе и температуре 65 °C. Выньте флаконы из раствора и тщательно промойте их дистиллированной водой. Поместите флаконы в стеклянный стакан, содержащий 2 N NaOH, и храните ультразвуком в течение 20 мин. На этом этапе нагревание не требуется. Выньте флаконы из раствора NaOH и тщательно промойте дистиллированной водой. Высушите флаконы в горячей воздушной печи, установленной при температуре 65 °C в течение 2 ч или дольше. Хранить очищенные флаконы в чистом стакане, запечатанном прозрачной пленкой, до 6 недель.ВНИМАНИЕ: Выполните следующие действия внутри химического вытяжного шкафа. Обрабатывайте хлороформ и липидные растворы газонепроницаемыми стеклянными шприцами Hamilton, чтобы избежать загрязнения пластиком. Промыть шприцы Гамильтона и несколько флаконов из янтарного стекла несколько раз чистым хлороформом. Возьмите липидный порошок, хранящийся в стеклянных ампулах, из морозильной камеры с температурой −20 °C и добавьте адекватные объемы хлороформа для растворения липидных порошков до концентраций 10-25 мг/мл. Перенесите раствор из ампулы в только что очищенный флакон из янтарного стекла и наклейте на него соответствующую метку. Выполните этот шаг на льду, чтобы уменьшить испарение хлороформа. Делают стоковый раствор DOPC с концентрацией 10-25 мг/мл и DGS-NTA-Ni2+ с концентрацией 1-10 мг/мл. Чтобы сделать рабочую липидную смесь, возьмите чистый стеклянный флакон и промойте его в 2 раза хлороформом. Добавьте 300 мкл чистого хлороформа во флакон, чтобы служить основой для лучшего смешивания компонентов. Это не повлияет на конечные концентрации липидов, так как весь хлороформ будет высушен на следующих этапах. Добавьте измеренные объемы стоковых липидных растворов во флакон, чтобы получить желаемые рабочие липидные смеси. Целевая концентрация липидов в буфере регидратации липидов составляет 4 мМ. Высушите липидную смесь под медленным потоком газа N2 внутри химической вытяжки при комнатной температуре. Этот шаг может занять до 30 минут для каждого флакона. После того, как весь растворитель высохнет, вакуумно высушите липидную пленку в течение >2 ч при комнатной температуре, чтобы удалить любые оставшиеся следы хлороформа. Повторное суспендирование высушенной липидной смеси в буфере регидратации липидов для получения конечной концентрации липидов 4 мМ. Инкубировать в течение 5-10 мин, чтобы обеспечить регидратацию липидов. Вихрь липидного раствора в течение примерно 30 с с образованием MLV. Сделайте 0,5-1 мл аликвот MLV в микроцентрифужных трубках по 1,5 мл. Погрузите трубки в жидкий азот, запечатайте прозрачной пленкой и храните при температуре −20 °C (до 6 недель).ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации липидного запаса выбираются таким образом, чтобы обеспечить достаточно большие объемы, которые позволяют надежно пипетировать с использованием шприцев Гамильтона. Если объемы, необходимые для изготовления бульона, слишком велики, чтобы растворить высушенный липидный порошок, сделайте многократные разведения материала, чтобы обеспечить воспроизводимое смешивание различных липидов. Подготовка небольших одноламеллярных везикул (БПЛА)Извлеките аликвоту MLV из хранилища −20°C и разморозьте ее при комнатной температуре. Вспышкой заморозьте везикулы, погрузив микроцентрифужную трубку в жидкий азот на 15-30 с и сразу же поставив ее на водяную баню, установленную при 45 °C, пока раствор полностью не разморозится (1-2 мин). Повторите вышеупомянутый цикл замораживания-оттаивания 10x-15x, пока раствор не станет менее мутным.ПРИМЕЧАНИЕ: Установите температуру водяной бани выше температуры перехода размораживаемой липидной смеси, чтобы обеспечить равномерное смешивание липидов. Уравновешивайте мини-экструдер на основе шприца, оснащенный поликарбонатной фильтрующей мембраной размером 80 нм с буфером регидратации SUV. Убедитесь, что в системе нет утечек или пузырьков. В то время как метод экструзии дает монодисперсные внедорожники с минимальным повреждением липидов, липидные смеси с отрицательным зарядом могут прилипать к поликарбонатной мембране. Осторожно пропустите размороженный липидный раствор через предварительно уравновешенный экструдер с одной стороны на другую, а затем обратно. Повторяют цикл 5х-10х до тех пор, пока липидный раствор не станет видимо прозрачным, что указывает на образование внедорожников диаметром ~100 нм. Центрифугируйте экструдированную суспензию (или кончик-ультразвуком раствор; см. примечание ниже) при 15 000 х г в течение 60 мин при 4 °C, чтобы гранулировать липидный мусор. Соберите верхние 80% раствора, не нарушая гранулы и не создавая пузырьков. Перенесите супернатант, содержащий внедорожники, в свежую микроцентрифужную трубку и храните на льду до 6 дней.ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой центрифугированию является обработка ультразвуком наконечника, выполняемая следующим образом. Включите ультразвуковой аппарат microtip и установите следующие настройки: Амплитуда = 30% от максимума, Время включения = 10 с, Время выключения = 60 с. Очистите наконечник микрозвукового аппарата деионизированной водой, затем 2 Н NaOH, хлороформом и снова деионизированной водой. Опустите наконечник ультразвукового аппарата в каждый из этих растворов и храните ультразвуком в течение 1-2 циклов, используя вышеуказанные настройки. Окуните чистый наконечник в замороженный-размороженный пузырьковый раствор и храните ультразвуком в течение 3-6 циклов на льду, пока раствор не очистится. После центрифугирования проверьте наличие признаков высокой деградации липидов или неудачной экструзии липидов в виде образования тонкой беловатой пленки и/или хорошо видимой гранулы. В этих случаях не продолжайте и повторяйте шаги подготовки внедорожника снова.ПРИМЕЧАНИЕ: Срок годности внедорожников может отличаться для разных липидных смесей. Внедорожники из DOPC: DGS-NTA-Ni2+ стабильны до 6 дней для целей этих экспериментов. Советы по решению распространенных проблем можно найти в таблице 2. Рисунок 2: Схема, показывающая рабочий процесс от подготовки многоламельных везикул и малых одноцветных везикул до образования поддерживаемых липидных бислоев. Создано с помощью Biorender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 2. Восстановление мембранно-привязанных актиновых сетей Подготовка пробоотборных камерВозьмите 3-5 прямоугольных стеклянных крышек и поместите их в банку Coplin. Включите ультразвуковой аппарат для ванны и установите температуру на 65 °C. Наполните банку Coplin 2% чистящим раствором, чтобы полностью погрузить крышки, и поместите ее в ультразвуковой аппарат на 30 минут в полноимпульсном режиме. Используйте тупые щипцы с покрытием из PTFE, чтобы удалить крышки один за другим из банки. Тщательно промойте их дистиллированной водой и поместите в другую банку Coplin, наполненную 2 N NaOH. Обрабатывать крышки ультразвуком в течение 20 минут в полноимпульсном режиме. Снимите крышки один за другим, тщательно промойте дистиллированной водой и поместите в другую банку Coplin, наполненную дистиллированной водой.ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию, обложите крышки ультразвуком в дистиллированной воде в течение 20 минут, а затем снова промойте их дистиллированной водой. Непосредственно перед началом эксперимента возьмите банку, содержащую крышки, в химическом вытяжке, оснащенном газоснабжением N2 . Оптимизируйте давление воздуха в газовом потоке N2 методом проб и ошибок, чтобы достаточно было просто вытеснить воду с поверхности крышки, не нарушая ее. Выровнять поток газа N2 параллельно плоскости крышки, чтобы уменьшить возможность разрушения крышки. Используйте перчатки и щипцы, чтобы снять чехлы один за другим из банки, чтобы высушить их под потоком N2 . Высушите обе стороны каждого чехлового листа и поместите их на чистую пластиковую сетку с крышкой. Поместите коробку с крышками в осушитель, чтобы избежать контакта с частицами пыли в воздухе.ПРИМЕЧАНИЕ: Высушенные крышкиN2 можно хранить в осушителе, где они могут оставаться гидрофильными в течение 2 дней. Эта стратегия может быть полезна, когда для эксперимента требуется много бислоев или если эксперимент занимает более 8 ч. Возьмите автоклавные трубки ПЦР и вырежьте их крышки и нижние конические половинки острым хирургическим лезвием. Возьмите цилиндрические полуразрезные трубки одну за другой, нанесите УФ-отверждаемый клей на гладкий ободок каждой разрезанной трубки и поместите его перевернутым на свежеочищенный покровный лист так, чтобы ободок сидел ровно на крышке. Не перемещайте цилиндр в боковом направлении, как только он расположен на крышке, чтобы клей не пролился в центральное пространство камеры. Прямоугольные крышки могут с комфортом вместить до трех реакционных камер, а круглые могут вместить только одну в центре (рисунок 1). Поместите крышки с подшипниками камеры внутрь УФ-озоноочистителя с подачей O2 и вакуумом (или используйте УФ-осветитель). Включите ультрафиолетовый свет и зажгите в течение 3-5 минут, чтобы клей полимеризовался. Выполняют более длительное освещение (10-15 мин) для улучшения гидрофильности покровного стекла и, следовательно, качества липидного бислоя. Храните сухие камеры для образцов с ультрафиолетовым освещением в течение 8 ч внутри небольших пластиковых коробок (таких как пустые прямоугольные крышки), обернутых прозрачной пленкой, чтобы уменьшить контакт с частицами пыли в воздухе.ПРИМЕЧАНИЕ: Постоянный поток O2 в присутствии ультрафиолетового света образует радикалы озона и кислорода, которые могут удалять органические примеси с поверхности покрова. Вакуум предотвратит утечку токсичного озона, который образуется в процессе. Выньте крышки и проверьте камеры на герметичность, заполнив их дистиллированной водой. Каждая камера может вместить до ~150 мкл образца. Выбросьте протекающие камеры.ПРИМЕЧАНИЕ: Еще одним отличным и безопасным вариантом очистки является плазменный очиститель. Настройки времени и мощности зависят от модели, но убедитесь, что вы не перегружаете стеклянные слайды плазмой, так как это приведет к снижению подвижности липидов. Обработка поверхности может влиять на подвижность липидов27, как это наблюдалось при длительной обработке чистящим раствором (>45 мин) или NaOH (>30 мин). Приготовление поддерживаемых липидных бислоевПромывайте каждую камеру буфером образования SLB (или 1x PBS), чтобы удалить любые поверхностные загрязнения, оставляя 100 мкл буфера на конце. Пометьте уровень буфера на уровне 100 мкл постоянным маркером для воспроизводимого отслеживания изменений объема. Добавьте в камеру 2 мкл 0,1 МCaCl2 . Это улучшает адсорбцию везикул к поверхности стекла, усиливая двухслойное образование на следующем этапе. Добавляют 8 мкл раствора внедорожника (со стадии 1.10.) в каждую камеру и инкубируют в течение 15 мин при 25 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Объем добавляемой смеси внедорожников можно оценить путем расчета общего количества липидов (со средней площадью 0,72 нм2), которые необходимы для полного покрытия открытой гидрофильной области скважины двумя липидными слоями. Смойте несвязанные везикулы с помощью буфера подвижности актина (1x KMEH). Во-первых, удалите 50 мкл буфера образования SLB, оставив только 50 мкл в камере образца. Во-вторых, добавьте в камеру 100 мкл 1x KMEH. Аккуратно перемешайте, а затем удалите 100 мкл буфера, не касаясь дна.ПРИМЕЧАНИЕ: Важно быть нежным во время стирки. Убедитесь, что наконечник пипетки не касается дна камеры. Держите пипетку наклонной, чтобы направить поток буфера к стенке камеры, а не непосредственно к бислою, так как прямой поток может нарушить бислой. Будьте осторожны, чтобы не вводить пузырьки воздуха во время пипетки, так как воздух может достичь липидного бислоя и вызвать дефекты в нем. Повторите промывку 10x, добавив 100 мкл 1x KMEH и удалив 100 мкл. Добавьте к бислою 10 мкл 1 мг/мл β-казеина, аккуратно перемешайте и инкубируйте в течение 5-10 мин. β-казеин блокирует участки на покровном листе, где бислой не сформировался. Смойте β-казеин 3x с 1x KMEH, как описано в шаге 2.2.3. и вернуть уровень буфера к отметке 100 мкл. Добавление мембранно-актинового линкераВо время инкубации β казеина (стадия 2.2.5.) вынимают аликвоту мембранно-актинового линкерного белка от −80 °C, быстро размораживают при 37 °C, а затем держат на льду. Разбавить аликвоту буфером разбавления белка до концентрации 1 мкМ. Добавьте линкерный белок в определенной конечной концентрации (обычно 5-20 нМ) и осторожно перемешайте. Чтобы обеспечить быстрое уравновешивание белка в камере, добавьте объемы, превышающие 20 мкл, предварительно смешав линкерный белок с 1x KMEH. Инкубировать в течение 40 мин при комнатной температуре. Промыть 3x с буфером KMEH 1x, чтобы удалить несвязанный белок HSE (как на шаге 2.2.3.). Доведите уровень буфера в каждой камере до отметки 100 мкл. Теперь образец готов к визуализации. Оценка качества липидного бислояПРИМЕЧАНИЕ: Это необязательный шаг, который не нужно выполнять каждый раз. Мы рекомендуем проводить эту оценку каждый раз, когда свежие внедорожники изготавливаются из замороженных запасов MLV.Включите микроскоп, лазеры возбуждения и камеры обнаружения. Убедитесь, что лазер выровнен, объектив очищен, а программное обеспечение готово к получению изображений. Нанесите масло на объектив 100x, установите образец на ступень микроскопа и сфокусируйте объектив на бислое. Убедитесь, что положение лазера таково, что он подвергается полному внутреннему отражению на образце. Используйте лазер возбуждения 488 нм для проверки распределения интенсивности флуоресценции двухслойного 10xHis-YFP-EzrinABD.ПРИМЕЧАНИЕ: Бислои хорошего качества показывают крупномасштабное, равномерное распределение интенсивности флуоресценции. Плохие бислои показывают интенсивные и пятнистые флуоресцентные пятна. Чтобы определить целостность бислоя, выполните анализ FRAP.Выберите интересующую область на бислое и запишите несколько изображений поля зрения, используя условия изображения, которые обеспечивают отношение сигнал/шум 5:1 или выше. Приостановите запись и закройте полевую диафрагму микроскопа TIRF, чтобы сфокусировать концентрированный лазерный луч на небольшой круговой области бислоя, чтобы локально отбелить флуорофоры. Включите лазер до максимальной мощности, чтобы фотоотбелить небольшую область в течение 3-10 с, а затем выключите лазер. Снова откройте полевую диафрагму до ее первоначального радиуса, перенастройте состояние визуализации обратно к настройкам (до отбеливания) и немедленно возобновите запись восстановления флуоресцентного сигнала в поле зрения. Проверьте, является ли бислой текучим. Хорошие бислои с нормальной боковой диффузией быстро восстанавливаются, в то время как плохие бислои восстанавливаются медленно или не восстанавливаются вообще (рисунок 3). Если двухслой не восстанавливается, обратитесь к разделу устранения неполадок и перезапустите его. Сохраните изображения в виде 16-битных файлов TIFF. Для количественной оценки коэффициента диффузии проверьте шаг 3. ниже. Полимеризация флуоресцентного актинаПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сэкономить время, начните полимеризацию актина во время инкубации белка HSE, связывающегося с бислоем (этап 2.3.) или во время оценки качества бислоя (этап 2.4.).Смешайте немаркированный и флуоресцентно меченый G-актин в молярном соотношении 10:1 и дополните его G-буфером таким образом, чтобы концентрация G-актина составляла 20 мкМ. Концентрация, при которой актин окончательно полимеризуется, составит 1/4 этого значения. Добавьте 1/10 10-кратного ME-буфера в смесь для 1-кратного раствора и инкубируйте в течение 2 мин. Этот шаг заменяет ионы Ca2+, связанные с G-актином, ионами Mg2+ . Убедитесь, что конечный объем кратен 10 мкл. Добавьте нужное количество белка, укупорочного белка следующим образом. Быстро разморозьте флакон с укупорочным белковым бульоном при 37 °C, а затем держите его на льду. Разбавляют G-буфером таким образом, чтобы концентрация укупорочного белка теперь в два раза превышала его желаемую конечную концентрацию в полимеризационной смеси. Добавьте равный объем разбавленного раствора укупорочного белка в смесь актинов со стадии 2.5.1. Наконец, добавьте равный объем свежего 2-кратного целевого буфера в реакционную смесь. Конечный объем раствора должен в четыре раза превышать объем актиновой смеси в конце шага 2.5.2. Убедитесь, что конечная концентрация KMEH составляет 1x, ATP составляет 1 мМ, BSA составляет 1 мг/мл, а G-актина составляет 5 мкМ.Инкубировать в темноте при 25 °C в течение 45-60 мин, чтобы произошла полимеризация.ПРИМЕЧАНИЕ: Это называется стратегией целевого буфера, в которой один объем Mg2+ G-актина (шаг 2.5.1.) смешивается с одним объемом укупорочной белковой смеси (этап 2.5.2.) и двумя объемами 2x целевого буфера (шаг 2.5.3.). Это облегчает масштабирование увеличения или уменьшения количества актина и изменение относительной концентрации укупорочного белка (или любого другого актин-модулятора); Рисунок 4). Добавление флуоресцентных актиновых нитейВырежьте несколько кончиков по 200 мкл острым лезвием или ножницами, чтобы сделать их тупыми. Аккуратно вылейте необходимый объем 5 мкМ полимеризованного актина (со стадии 2.5.3.) тупым наконечником пипетки (для предотвращения сдвига актиновых нитей) и добавьте его в чистую автоклавную трубку ПЦР. Добавьте 1x KMEH в трубку, чтобы объем >20 мкл и осторожно перемешайте, чтобы избежать сдвига F-актина. Из установленной камеры для отбора проб извлеките равный объем буфера. Добавьте полимеризованный раствор актина в камеру и аккуратно пипеткой вверх и вниз 3 раза, не касаясь бислоя внизу. Это позволяет актиновым нитям равномерно распределяться по бислою. Установите образец на микроскоп TIRF (см. этап 2.4.1 и шаг 2.4.2). Можно записать процесс связывания F-актина с бислоем. Инкубировать в течение 20-30 мин. Запишите несколько изображений из разных полей зрения после того, как добавление F-актина достигло устойчивого состояния. Наблюдают изменение пространственной организации 10xHis-YFP-EzrinABD до (однородной) и после актиновой организации.ПРИМЕЧАНИЕ: HYE равномерно распределяется по липидному бислою в отсутствие актина. При добавлении актиновых нитей HYE колокализуется с F-актином. Степень колокализации зависит от актин-связывающего сродства белка-линкера; чем сильнее сродство, тем выше колокализация и тем медленнее латеральная подвижность белка-линкера (рисунок 5). Добавление миозина IIПосле 30 мин инкубации актина установите образец обратно на микроскоп (если он был размонтирован). Проверьте сигнал в линкерных белковых и F-актиновых каналах. При необходимости отрегулируйте условия визуализации. Выберите хорошую область с равномерным сигналом белка линкера и равномерно рассеянными актиновыми нитями и без артефактов для длительной записи. Запишите 10-15 кадров при частоте 0,1-0,2 Гц перед добавлением миозина и приостановите запись. Пипетка извлекает необходимый объем переработанного мышечного миозина-II из запасного флакона с тупым наконечником пипетки (для предотвращения сдвига миозиновых нитей) и добавляет в чистую автоклавную трубку ПЦР. Немедленно добавьте 1x KMEH в трубку, чтобы объем >20 мкл и аккуратно перемешайте. Можно также добавить АТФ, регенерирующую смесь АТФ, фотостабилизирующие агенты и т.д. на этом шаге. Осторожно извлеките равный объем буфера из установленной камеры для отбора проб, не нарушая его. Аккуратно добавьте раствор миозина в пробную камеру. Не пипетку вверх и вниз, так как это потревожит связанные с поверхностью нити. Немедленно возобновите покадровую регистрацию и наблюдайте за системой, как она эволюционирует из состояния до миозина к сокращенным потокам акто-миозина, подпитываемому АТФ, и образованию астры в истощенное АТФ состояние (см. репрезентативные результаты). Сделайте фоновые изображения для всех каналов, используя только образец буфера. Сохраните все изображения в виде 16-битных .tiff файлов. Советы по решению распространенных проблем см. в таблице 2 . Рисунок 3: Оценка качества бислоев с помощью быстрого анализа FRAP. Поддерживаемые липидные бислои (SLB), полученные из липидов DOPC и Ni-NTA (98:2 моль%), покрыты HYE (10xHis-YFP-меченый мембранно-актиновый линкер). После того, как несвязанный белок вымывается, флуоресцентный бислой визуализируется под микроскопом TIRF. Небольшая область на бислое фотоотбеливается высокой мощностью лазера, и регистрируется восстановление флуоресценции. (A) Хороший бислой всегда быстро восстанавливается с ожидаемым коэффициентом диффузии 1-1,5 мкм2/с для липидной композиции, используемой в этом случае. (B) Плохие бислои восстанавливаются очень медленно или не восстанавливаются вообще. (C) Репрезентативные изображения плохих бислоев: (C-i) бислой с отверстиями, (C-ii) бислой с большими, неподвижными липидными пятнами и (C-iii) бислой с маленькими, неподвижными точками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Схема, показывающая, как полимеризовать актин с помощью целевого буферного метода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Пространственная организация HYE при связывании с F-актином. Снимки TIRF, показывающие пространственную организацию HYE до и после добавления актиновых нитей (маркированных atto-635 maleimide). Организация HYE однородна до добавления F-актина и становится колокализованной и сросшейся вдоль актиновых нитей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 3. Анализ данных Используя программное обеспечение Fiji (https://imagej.net), вычтите фон из изображений белка линкера (из шага 2.4.). Измерьте средние значения интенсивности по обесцвеченному пятну и контрольной области. Нормализуйте временные следы от обесцвеченного пятна и опорной области до интенсивности их соответствующих значений интенсивности до отбеливания. Разделите каждую точку времени в нормализованных значениях отбеленной области на соответствующие точки времени в нормализованной временной трассировке опорной области. Скорректируйте результирующую нормированную временную трассировку для фона и для любых систематических колебаний интенсивности во время съемки (глобальное фотоотбеливание, z-дрейф и т.д.).Используйте ручной метод28 без подгонки для оценки коэффициента диффузии двухслойных привязанных белков. Вкратце, половинное время профиля восстановления, τ1/2, можно рассчитать, посмотрев на время, когда нормализованный профиль восстановления достигает половины своего устойчивого состояния:Здесь F0 — средняя интенсивность в обесцвеченной области в первом кадре после фотоотбеливания, а F∞ — долгосрочное устойчивое значение восстановления бислоя. Оцените эффективный радиус отбеливания, re, параметр, который корректирует диффузию во время фотоотбеливания, из линейного сканирования профиля29 пятна после отбеливания. Половинная ширина в половину минимума этого линейного сканирования, проходящего через центр пятна отбеливателя, r1/2, относится к re следующим образом:τ1/2, рассчитанный на шаге 2.8.3., re, рассчитанный на шаге 2.8.4., и первоначально заданный радиус отбеливания, rn, используются для расчета коэффициента диффузии (D) по следующей формуле: Анализ изображений астр актомиозинаИспользуя Фиджи, вычтите фон из всех записанных изображений во всех каналах. Исправьте изображения для любого неравномерного освещения или интерференционной картины с помощью коррекции плоского поля.ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать цветные пластиковые слайды, которые являются хорошими плоскими образцами для такой коррекции. Для линкерных белковых и актиновых нитей на плоском бислое можно также использовать среднюю проекцию нескольких премиозиновых изображений для создания карт коррекции освещения для конкретных каналов.Для канала HYE, показанного здесь, возьмите проекцию средней интенсивности нескольких изображений HYE (записанных из разных областей липидного бислоя до добавления миозина). Примените соответствующий фильтр Гаусса (σ = от 50 до 80 пикселей) к средней проекции (из изображений до миозина или любого стандартного плоского образца). Преобразуйте отфильтрованное изображение в 32-разрядное. Разделите все значения пикселей на среднее значение всего изображения. Это даст нормализованную карту коррекции для канала HYE. Разделите все изображения в канале HYE с помощью этой карты для коррекции плоского поля. Создавайте корректирующие карты для других каналов, используя ту же стратегию. Корректируется для фотоотбеливания с использованием метода экспоненциального или простого соотношения (в зависимости от профиля интенсивности распада) на Фиджи.Чтобы исправить любое временное смещение x-y (поступательное движение), объедините все каналы с коррекцией фотоотбеливания в один Гиперстек. Используя плагин Hyperstack-Reg на Фиджи, примените преобразование «Твердое тело» или «Перевод». Наконец, разделите выровненный Hyperstack на отдельные каналы и сохраните их отдельно в виде 16-битных стеков TIFF для дальнейшего анализа.