שיטת ניקוי רקמות להדמיה עצבית מסולמות מזוסקופיים למיקרוסקופיים
Summary
הפרוטוקול מספק שיטה מפורטת של הדמיה עצבית בפרוסת המוח באמצעות שיטת ניקוי רקמות, ScaleSF. הפרוטוקול כולל הכנת רקמות מוח, הבהרת רקמות, טיפול בפרוסות מנוקות והדמיית מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית של מבנים עצביים מרמות מזוסקופיות למיקרוסקופיות.
Abstract
פרוטוקול מפורט מסופק כאן כדי לדמיין מבנים עצביים מרמות מזוסקופיות למיקרוסקופיות ברקמות המוח. מבנים עצביים הנעים בין מעגלים עצביים למבנים עצביים תת-תאיים מוצגים באופן חזותי בפרוסות מוח של עכברים המנוקות אופטית באמצעות ScaleSF. שיטת ניקוי זו היא גרסה שונה של ScaleS והיא שיטה הידרופילית לניקוי רקמות עבור פרוסות רקמה שמשיגה יכולת ניקוי חזקה כמו גם רמה גבוהה של שימור אותות פלואורסצנטיים ושלמות מבנית. תא הדמיה תלת-ממדי (תלת-ממדי) הניתן להתאמה אישית (3D) מתוכנן להרכבה אמינה של רקמות מוח מנוקות. מוחות עכברים שהוזרקו להם וקטור נגיף הקשור לאדנו הנושא גן חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר תוקנו עם 4% פרפורמלדהיד ונחתכו לפרוסות בעובי של 1 מ”מ עם פרוסת רקמה רוטטת. פרוסות המוח נוקו על ידי ביצוע פרוטוקול הסליקה, הכולל דגירות עוקבות בשלוש תמיסות, כלומר, תמיסת ScaleS0, מלח חיץ פוספט (–) ותמיסת ScaleS4, בסך הכל 10.5–14.5 שעות. פרוסות המוח המנוקות הותקנו על תא ההדמיה והוטמעו בג’ל אגרוז של 1.5% שהומס בתמיסת ScaleS4D25(0). רכישת התמונה התלת-ממדית של הפרוסות בוצעה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי המצויד בעדשה אובייקטיבית מרובת טבילות של מרחק עבודה ארוך. החל מהדמיה עצבית מזוסקופית, הצלחנו לדמיין מבנים עצביים תת-תאיים עדינים, כגון עמודי שדרה דנדריטיים ובוטונים אקסונאליים, בפרוסות המוח המנוקות אופטית. פרוטוקול זה יקל על הבנת המבנים העצביים מקנה מידה של מעגלים לרכיבים תת-תאיים.
Introduction
שיטות ניקוי רקמות שיפרו הדמיה בלתי תלוית עומק של דגימות ביולוגיות וקליניות באמצעות מיקרוסקופיה קלה, ואפשרו מיצוי של מידע מבני על רקמות שלמות 1,2. טכניקות ניקוי אופטיות עשויות גם להאיץ, ולהפחית את העלות עבור ניתוח היסטולוגי. נכון לעכשיו, קיימות שלוש גישות סליקה עיקריות: שיטות הידרופיליות, הידרופוביות ומבוססות הידרוג’ל 1,2. הגישות ההידרופיליות עולות בשמירה על אותות פלואורסצנטיים ושלמות הרקמות והן פחות רעילות בהשוואה לשתי הגישות האחרות 3,4.
שיטת סליקה הידרופילית, ScaleS, מחזיקה בעמדה ייחודית עם שימור השלמות המבנית והמולקולרית שלה, כמו גם יכולת הסליקה החזקה (ספקטרום ניקוי-שימור)5. במחקר קודם פיתחנו פרוטוקול סליקה מהיר ואיזומטרי, ScaleSF, לפרוסות רקמה (בעובי של כ-1 מ”מ) על ידי שינוי הליך הסליקה של ScaleS6. פרוטוקול סליקה זה דורש דגירות עוקבות של פרוסות מוח בשלושה פתרונות למשך 10.5-14.5 שעות. השיטה מוצגת עם ספקטרום גבוה של ניקוי-שימור, התואם אפילו לניתוח מיקרוסקופיית אלקטרונים (EM) (איור משלים 1), המאפשר הדמיה תלת-ממדית (תלת-ממדית) רב-ממדית ברזולוציה גבוהה (3D) עם שחזור אותות מדויק6. לפיכך, ScaleSF צריך להיות יעיל במיוחד במוח, שבו תאי עצב מפרטים תהליכים שופעים באורך עצום, ומסדרים מבנים תת-תאיים עדינים מיוחדים להעברת וקבלת מידע. חילוץ מידע מבני עם קשקשים מרמות מעגליות לתת-תאיות על תאים עצביים הוא די שימושי להבנה טובה יותר של תפקודי המוח.
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט להדמיית מבנים עצביים עם קשקשים מהרמה המזוסקופית/מעגלית לרמה המיקרוסקופית/תת-תאית באמצעות ScaleSF. הפרוטוקול כולל הכנת רקמות, הבהרת רקמות, טיפול ברקמות מנוקות והדמיית מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית (CLSM) של רקמות מנוקות. הפרוטוקול שלנו מתמקד בחקירת מבנים עצביים מקנה מידה של מעגלים לרכיבים תת-תאיים. לקבלת הליך מפורט להכנת הפתרונות והזרקה סטריאוטקסית של וקטורים הקשורים לנגיף אדנו (AAV) למוחם של עכברים, עיין ב- Miyawaki et al. 20167 ו- Okamoto et al. 20218, בהתאמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים בפרוטוקול
ישנם כמה שלבים קריטיים בפרוטוקול שיש לבצע בזהירות מרבית כדי להשיג תוצאות משמעותיות. קיבוע אחיד של דגימות הוא הכרחי להדמיה תלת-ממדית בתוך רקמות בקנה מידה גדול. העדשה האובייקטיבית, המדגם ונוזל הטבילה צריכים להיות בעלי RI תואם. אי-התאמה של RI ביניהם תוביל להד…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים ליוקו אישידה (אוניברסיטת ג’ונטנדו) על ייצור וקטור AAV ולקיסארה הושינו (אוניברסיטת ג’ונטנדו) על הסיוע הטכני. מחקר זה נתמך על ידי JSPS KAKENHI (JP20K07231 עד K.Y.; JP21H03529 עד T.F.; JP20K07743 עד M.K.; JP21H02592 עד H.H.) ומחקר מדעי על אזור חדשני “תהודה ביו” (JP18H04743 עד H.H.). מחקר זה נתמך גם על ידי הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (AMED) (JP21dm0207112 ל- T.F. ו- H.H.), מו”פ Moonshot מסוכנות המדע והטכנולוגיה של יפן (JST) (JPMJMS2024 עד H.H.), מחקר מונחה היתוך למדע וטכנולוגיה משבשים (יער) מ- JST (JPMJFR204D עד H.H.), מענקים בסיוע ממכון המחקר למחלות זקנה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג’ונטנדו (X2016 עד K.Y.; X2001 ל-H.H.), ופרויקט מיתוג בתי הספר הפרטיים.
Materials
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
References
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Furuta, T., et al. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 25 (1), 103601 (2022).
- Miyawaki, A., et al. Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy. Protocol Exchange. , (2016).
- Okamoto, S., et al. Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system. STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).
- Kameda, H., et al. Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites. The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).
- Sohn, J., et al. A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system. PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).
- Kuramoto, E., et al. Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors. Cerebral Cortex. 19 (9), 2065-2077 (2009).
- Matsuda, W., et al. Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
- Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6, 34331 (2016).
