Een weefselzuiveringsmethode voor neuronale beeldvorming van mesoscopische tot microscopische schalen
Summary
Het protocol biedt een gedetailleerde methode van neuronale beeldvorming in hersensegmenten met behulp van een weefselzuiveringsmethode, ScaleSF. Het protocol omvat hersenweefselvoorbereiding, weefselverheldering, behandeling van gewiste plakjes en confocale laserscanmicroscopie beeldvorming van neuronale structuren van mesoscopische tot microscopische niveaus.
Abstract
Een gedetailleerd protocol wordt hier verstrekt om neuronale structuren van mesoscopische tot microscopische niveaus in hersenweefsels te visualiseren. Neuronale structuren, variërend van neurale circuits tot subcellulaire neuronale structuren, worden gevisualiseerd in hersensneden van muizen die optisch zijn gewist met ScaleSF. Deze clearingmethode is een aangepaste versie van ScaleS en is een hydrofiele weefselzuiveringsmethode voor weefselplakken die krachtige clearingcapaciteit bereikt, evenals een hoog niveau van behoud van fluorescentiesignalen en structurele integriteit. Een aanpasbare driedimensionale (3D) geprinte beeldkamer is ontworpen voor betrouwbare montage van vrijgemaakte hersenweefsels. Muizenhersenen geïnjecteerd met een adeno-geassocieerde virusvector met verbeterd groen fluorescerend eiwitgen werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde en in plakjes van 1 mm dikte gesneden met een trillende weefselsnijder. De hersenschijfjes werden gewist door het clearingprotocol te volgen, dat sequentiële incubaties in drie oplossingen omvat, namelijk ScaleS0-oplossing, fosfaatbufferzoutoplossing (–) en ScaleS4-oplossing, voor een totaal van 10,5-14,5 uur. De gewiste hersenplakken werden op de beeldkamer gemonteerd en ingebed in 1,5% agarose-gel opgelost in ScaleS4D25(0)-oplossing. De 3D-beeldacquisitie van de plakjes werd uitgevoerd met behulp van een confocale laserscanmicroscoop uitgerust met een multi-immersie objectieflens van een lange werkafstand. Beginnend met mesoscopische neuronale beeldvorming, slaagden we erin om fijne subcellulaire neuronale structuren, zoals dendritische stekels en axonale boutons, in de optisch geklaarde hersenplakken te visualiseren. Dit protocol zou het begrip van neuronale structuren van circuit- tot subcellulaire componentschalen vergemakkelijken.
Introduction
Weefselopruimingsmethoden hebben de diepte-onafhankelijke beeldvorming van biologische en klinische monsters met lichtmicroscopie verbeterd, waardoor structurele informatie over intacte weefsels kan worden geëxtraheerd 1,2. Optische clearingtechnieken kunnen mogelijk ook versnellen en de kosten voor histologische analyse verlagen. Momenteel zijn er drie belangrijke clearingbenaderingen beschikbaar: hydrofiele, hydrofobe en hydrogel-gebaseerde methoden 1,2. Hydrofiele benaderingen overtreffen in het behoud van fluorescentiesignalen en weefselintegriteit en zijn minder toxisch in vergelijking met de andere twee benaderingen 3,4.
Een hydrofiele clearingmethode, ScaleS, heeft een onderscheidende positie met zijn behoud van structurele en moleculaire integriteit en krachtige clearingcapaciteit (clearing-preservation spectrum)5. In een eerdere studie ontwikkelden we een snel en isometrisch clearingprotocol, ScaleSF, voor weefselplakken (~ 1 mm dikte) door de clearingprocedure van ScaleS6 te wijzigen. Dit clearingprotocol vereist sequentiële incubaties van hersenplakken in drie oplossingen gedurende 10,5-14,5 uur. De methode is voorzien van een hoog clearing-preserveringsspectrum, dat zelfs compatibel is met elektronenmicroscopie (EM) -analyse (aanvullende figuur 1), waardoor multischaal hoge resolutie driedimensionale (3D) beeldvorming met nauwkeurige signaalreconstructiemogelijk is 6. ScaleSF zou dus effectief moeten zijn, vooral in de hersenen, waar neuronale cellen uitbundige processen van enorme lengte uitwerken en gespecialiseerde fijne subcellulaire structuren regelen voor het verzenden en ontvangen van informatie. Het extraheren van structurele informatie met schalen van circuit- tot subcellulaire niveaus op neuronale cellen is heel nuttig voor een beter begrip van hersenfuncties.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol om neuronale structuren te visualiseren met schalen van het mesoscopische / circuit tot microscopisch / subcellulair niveau met behulp van ScaleSF. Het protocol omvat weefselvoorbereiding, weefselzuivering, behandeling van gewiste weefsels en confocale laserscanmicroscopie (CLSM) beeldvorming van gewiste weefsels. Ons protocol richt zich op het ondervragen van neuronale structuren van circuit- tot subcellulaire componentschalen. Voor een gedetailleerde procedure voor de bereiding van de oplossingen en stereotaxische injectie van adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren in muizenhersenen, zie respectievelijk Miyawaki et al. 20167 en Okamoto et al. 20218.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritieke stappen binnen het protocol
Er zijn een paar kritieke stappen in het protocol die met de grootste voorzichtigheid moeten worden uitgevoerd om zinvolle resultaten te verkrijgen. Uniforme fixatie van monsters is noodzakelijk voor 3D-beeldvorming in grootschalige weefsels. De objectieflens, het monster en de onderdompelingsvloeistof moeten overeenkomende RI hebben. RI-mismatch tussen hen zal leiden tot zeer verstoorde beeldvorming van EGFP-expresserende cellen in de gewiste hersenplakken (<stron…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Yoko Ishida (Juntendo University) voor AAV vectorproductie en Kisara Hoshino (Juntendo University) voor technische assistentie. Deze studie werd ondersteund door JSPS KAKENHI (JP20K07231 tot K.Y.; JP21H03529 naar T.F.; JP20K07743 naar M.K.; JP21H02592 naar H.H.) en Wetenschappelijk onderzoek naar innovatief gebied “Resonantie Bio” (JP18H04743 tot H.H.). Deze studie werd ook ondersteund door het Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (JP21dm0207112 tot T.F. en H.H.), Moonshot R&D van het Japan Science and Technology Agency (JST) (JPMJMS2024 tot H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) van JST (JPMJFR204D tot H.H.), Grants-in-Aid van het Research Institute for Diseases of Old Age aan de Juntendo University School of Medicine (X2016 tot K.Y.; X2001 tot H.H.), en het Private School Branding Project.
Materials
| 16x multi-immersion objective lens | Leica Microsystems | HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR | |
| Agar | Nacalai Tesque | 01028-85 | |
| Agarose | TaKaRa Bio | L03 | |
| Dimethyl sulfoxide | Nacalai Tesque | 13407-45 | |
| D-Sorbitol | Nacalai Tesque | 06286-55 | |
| γ-cyclodextrin | Wako Pure Chemical Industries | 037-10643 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Huygens Essential | Scientific Volume Imaging | ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b | |
| Imaris | Bitplane | ver. 9.0.0 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | LAS X, ver. 3.5.5.19976 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Tokyo Chemical Industry | M1356 | |
| Paraformaldehyde | Merck Millipore | 1.04005.1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4) | Nacalai Tesque | 27575-31 | 10x PBS(–) |
| Sodium azide | Nacalai Tesque | 31233-55 | |
| Sodium pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | N/A | |
| TCS SP8 | Leica Microsystems | N/A | |
| Triton X-100 | Nacalai Tesque | 35501-15 | |
| Urea | Nacalai Tesque | 35940-65 | |
| Vibrating tissue slicer | Dosaka EM | PRO7N |
References
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Furuta, T., et al. Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF. iScience. 25 (1), 103601 (2022).
- Miyawaki, A., et al. Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy. Protocol Exchange. , (2016).
- Okamoto, S., et al. Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system. STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).
- Kameda, H., et al. Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites. The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).
- Sohn, J., et al. A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system. PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).
- Kuramoto, E., et al. Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors. Cerebral Cortex. 19 (9), 2065-2077 (2009).
- Matsuda, W., et al. Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).
- Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure. Scientific Reports. 6, 34331 (2016).
