Summary

Isolamento de Preadipócitos de Embriões de Broiler Chick

Published: August 04, 2022
doi:

Summary

O presente protocolo descreve um método simples para isolar pré-apócitos do tecido adiposo em embriões de frango. Este método permite o isolamento com alto rendimento, cultura primária e diferenciação adipogênica de pré-apócitos. Manchas de óleo Vermelho O e mancha lipídica/DNA mediram a capacidade adipogênica de células isoladas induzidas com meios de diferenciação.

Abstract

Pré-iadipócitos primários são um valioso sistema experimental para entender as vias moleculares que controlam a diferenciação e o metabolismo adipócitos. Embriões de frango oferecem a oportunidade de isolar os pré-idócitos do estágio inicial do desenvolvimento adiposo. Esta célula primária pode ser usada para identificar fatores que influenciam a proliferação de pré-doenças e a diferenciação adipogênica, tornando-as um modelo valioso para estudos relacionados à obesidade infantil e controle do excesso de deposição de gordura em aves de capoeira. O rápido crescimento do tecido adiposo pós-natal efetivamente desperdiça ração, alocando-o longe do crescimento muscular em frangos de corte. Portanto, métodos para entender os estágios iniciais do desenvolvimento de tecidos adiposos podem fornecer pistas para regular essa tendência e identificar maneiras de limitar a expansão adiposa no início da vida. O presente estudo foi concebido para desenvolver um método eficiente de isolamento, cultura primária e diferenciação adipogênica de pré-iadipócitos isolados do desenvolvimento de tecido adiposo de embriões de filhotes de frango comercial (tipo carne). O procedimento foi otimizado para produzir células com alta viabilidade (~98%) e capacidade aumentada de diferenciação em adipócitos maduros. Este método simples de isolamento, cultura e diferenciação pré-apócis embrionárias suporta análises funcionais de crescimento e desenvolvimento de gordura no início da vida.

Introduction

A obesidade é uma ameaça à saúde global para adultos e crianças. Crianças com sobrepeso ou obesidade têm aproximadamente cinco vezes mais chances de serem obesas quando adultos, colocando-as em risco significativamente aumentado para doenças cardiovasculares, diabetes e muitas outras comorbidades. Cerca de 13,4% das crianças norte-americanas de 2 a 5 anos têm obesidade1, ilustrando que a tendência de acumular excesso de gordura corporal pode ser iniciada muito cedo na vida. Por razões muito diferentes, o acúmulo de excesso de tecido adiposo é uma preocupação para frangos de corte (tipo carne). Os frangos modernos são incrivelmente eficientes, mas ainda acumulam mais lipídios do que é fisiologicamente necessário 2,3. Essa tendência começa logo após o hatch e efetivamente desperdiça ração, o componente de produção mais caro, alocando-o longe do crescimento muscular. Portanto, tanto para crianças quanto para galinhas de corte, embora por razões muito diferentes, há a necessidade de entender fatores que influenciam o desenvolvimento de tecidos adiposos e identificar maneiras de limitar a expansão adiposa no início da vida.

Os adipócitos formam-se de pré-apócitos, células-tronco derivadas de tecido adiposo que sofrem diferenciação para desenvolver células de gordura maduras e armazenadas por lipídios. Assim, os pré-apócitos in vitro são um modelo experimental valioso para estudos de obesidade. Essas células, isoladas da fração vascular estromica dos depósitos adiposos, podem fornecer uma compreensão fundamental das vias moleculares que controlam a diferenciação de adipócitos e o metabolismo 4,5. Os embriões de pintinhos são um modelo experimental favorável em estudos de desenvolvimento porque a colheita de ovos no cronograma desejado facilita a manipulação experimental, pois permite a obtenção de embriões sem o sacrifício da mãe para observar uma série de estágios de desenvolvimento de embriões. Além disso, procedimentos cirúrgicos complicados e longos períodos de tempo não são necessários para obter embriões relativos a modelos animais maiores. Portanto, o embrião do filhote apresenta uma oportunidade de obter pré-nascidos desde os estágios iniciais do desenvolvimento do tecido adiposo. O tecido adiposo subcutâneo torna-se visível no filhote em torno do dia embrionário 12 (E12) como um depósito claramente definido localizado ao redor da coxa. Este depósito é enriquecido em pré-iadipócitos altamente proliferativos que passam ativamente por diferenciação sob pistas de desenvolvimento para formar adipócitos maduros 6,7. O processo de diferenciação adipogênica é comparável entre galinhas e humanos. Portanto, preadipócitos isolados de embriões de filhotes podem ser usados como modelo de dupla finalidade para estudos relevantes para humanos e aves. No entanto, o rendimento dos preadipócitos diminui com o envelhecimento à medida que as células crescem em adipócitos maduros5.

O presente protocolo otimiza o isolamento de pré-nascidos do tecido adiposo durante a etapa (E16-E18) em que a diferenciação adipogênica e a hipertrofia adipócite estão no seu auge em embriões de filhotesde corte 8. Este procedimento pode avaliar os efeitos de fatores aos quais o embrião em desenvolvimento está exposto no ovo, como a dieta da galinha, sobre o desenvolvimento de adipócitos e potencial adipogênico ex vivo. Também pode testar o impacto de várias manipulações (por exemplo, hipóxia, adições de nutrientes, agonistas farmacológicos e antagonistas) sobre adipogênese ou os vários ‘omes (por exemplo, transcrito, metabolome, metilome) de progenitores adipócitos. Como representação do estágio inicial da formação adiposa, as células obtidas usando este protocolo são modelos valiosos para estudos relevantes para aves e seres humanos.

Protocol

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Tennessee. Ovos de frango comercial recém-fertilizados (Cobb 500) foram obtidos de um incubatório local. Os ovos foram incubados a 38 °C com 60% de umidade relativa até dissecções nos dias embrionários 16-18 (E16-E18). O tecido adiposo foi coletado do depósito subcutâneo (femoral). 1. Preparação para o isolamento e a cultura Prepare o c…

Representative Results

Os pré-apócis primários são morfologicamente semelhantes aos fibroblastos, com formas irregulares, semelhantes a estrelas e um núcleo central (Figura 2A-C). As células prontamente aderem à cultura tecidual e começam a proliferar logo após o apego. Eles rapidamente se diferenciam e acumulam gotículas lipídicas (Figura 3D) quando fornecidos com ácidos graxos na mídia. A viabilidade (98%, baseada na exclusão de corant…

Discussion

Embora vários protocolos bem descritos tenham relatado o isolamento de pré-doenças 14,15,16,17, o isolamento para preadipócitos embrionários foi otimizado, o que pode ser usado para análises funcionais do crescimento e desenvolvimento de gorduras no início da vida. Este protocolo produz progenitores adipócidos embrionários de alta viabilidade com alto potencial de diferenciação. Alé…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem à UT AgResearch e ao Departamento de Zootecnia por apoiarem e otimizarem esse protocolo. Este trabalho foi financiado por subvenção do USDA.

Materials

1 mL Pipette Eppendorf Z683825 Single Channel Pipette, 100 – 1000 µL
1 mL Pipette Tip Fisher Scientific 02-707-402
100% Isopropanol Fisher Scientific A426P4
1x PBS Gibco 10010023
25 mL Flask Pyrex 4980-25
37% Formaldehyde Fisher Scientific F75P-1GAL
6-Well Plate Falcon 353046 Tissue Culture-treated
96-Well Assay Plate Costar 3632
96-Well Plate, Black Bottom Costar 3603 Tissue Culture-treated
AdipoRed Lonza PT-7009
Amphotericin B Gibco 15290026
Bench Top Wiper (Kimtechwiper) Kimberly-Clark 34155
Betadine Up & Up NDC 1167300334 20% Working Solution
Cell Counter Corning 6749
Cell Strainer, 40 µm SPL 93040
Centrifugaton Eppendorf 5702
Chicken Serum Gibco 16110082
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL VWR 10025-690
Conical Centrifuge Tubes, 50 mL Falcon 352098
Cryovial Nunc 343958
Curved Forceps, 100 mm Roboz Surgical RS-5137
Curved Surgical Scissors, 115 mm Roboz Surgical RS-6839
Distilled Water Millipore SYNSV0000 Despensed as needed
DMEM/F12 HyClone SH30023.01
DMSO Sigma D2650
Ethanol Decon Labs 2701 70% Working Solution
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10437028
Fluorescent Microscope Evos M7000
Fluorescent Plate Reader Biotek Synergy H1
Foil Reynolds Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT.
Freezing Container Thermo Scientific 5100-0001
Gelatin Millipore 4055 2% Working Solution
Hematocytometer (Counting Chamber) Corning 480200 0.1 mm deep
Incubator Fisher Scientific 6845
Instrument Sterilizer VWR B1205
Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin Sigma L9655 1x Working Solution
Microscope Evos AMEX1000
Multi-Channel Pipette Thermo Scientific 4661070 12-Channel Pipetters, 30 – 300 µL
Na2HPO4 Sigma S-7907
NaH2PO4 Sigma S-3139
NucBlue Invitrogen R37605
Oil Red O Sigma O-0625
Orbital Shaker IKA KS130BS1
Paper Towel Tork RK8002
Parafilm Parafilm M PM996
Penicillin/Steptomycin (P/S) Gibco 15140122 1x Working Solution
Petri dishes, 100 mm Falcon 351029
Petri dishes, 60 mm Falcon 351007
Plate Shaker VWR 200
RBC Lysis Buffer Roche 11814389001
Reagent Reservior VWR 89094-680
Small Beaker, 100 mL Pyrex 1000-100
Spectrophotometer Plate Reader Biotek Synergy H1
Sterile Gauze McKesson 762703
Straight Forceps, 120 mm Roboz Surgical RS-4960
Straight Scissors, 140 mm Roboz Surgical RS-6762
T-25 Flask Corning 430639 Tissue Culture-treated
Tissue Culture Incubator Thermo Scientific 50144906
Tissue Strainer, 250 µm Pierce 87791
Trypan Blue Stain Gibco 15250061
Trypsin Gibco 15400054 0.1% Working Solution
Tweezers, 110 mm Roboz Surgical RS-5035
Type 1 Collagenase Gibco 17100017
Water Bath Fisher Scientific 15-462-10
Whatman Grade 1 Filter Paper Whatman 1001-110

References

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Cite This Article
Kim, M., Jung, U., Shepherd, E., Mihelic, R., Voy, B. H. Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos. J. Vis. Exp. (186), e63861, doi:10.3791/63861 (2022).

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