Summary

Isolamento dei preadipociti dagli embrioni di pulcino di pollo

Published: August 04, 2022
doi:

Summary

Il presente protocollo descrive un metodo semplice per isolare i preadipociti dal tessuto adiposo negli embrioni di polli da carne. Questo metodo consente l’isolamento con alta resa, coltura primaria e differenziazione adipogenica dei preadipociti. La colorazione Oil Red O e la colorazione lipidico/DNA hanno misurato la capacità adipogenica delle cellule isolate indotte con mezzi di differenziazione.

Abstract

I preadipociti primari sono un prezioso sistema sperimentale per comprendere le vie molecolari che controllano la differenziazione e il metabolismo degli adipociti. Gli embrioni di pollo offrono l’opportunità di isolare i preadipociti fin dalla prima fase dello sviluppo adiposo. Questa cellula primaria può essere utilizzata per identificare i fattori che influenzano la proliferazione dei preadipociti e la differenziazione adipogenica, rendendoli un modello prezioso per gli studi relativi all’obesità infantile e al controllo della deposizione di grasso in eccesso nel pollame. La rapida crescita del tessuto adiposo postnatale spreca efficacemente il mangime allocandolo lontano dalla crescita muscolare nei polli da carne. Pertanto, i metodi per comprendere le prime fasi dello sviluppo del tessuto adiposo possono fornire indizi per regolare questa tendenza e identificare modi per limitare l’espansione adiposa all’inizio della vita. Il presente studio è stato progettato per sviluppare un metodo efficiente per l’isolamento, la coltura primaria e la differenziazione adipogenica dei preadipociti isolati dallo sviluppo del tessuto adiposo di embrioni di pulcino di polli da carne commerciali (tipo carne). La procedura è stata ottimizzata per produrre cellule con elevata vitalità (~ 98%) e una maggiore capacità di differenziarsi in adipociti maturi. Questo semplice metodo di isolamento, coltura e differenziazione dei preadipociti embrionali supporta le analisi funzionali della crescita e dello sviluppo del grasso nei primi anni di vita.

Introduction

L’obesità è una minaccia per la salute globale sia per gli adulti che per i bambini. I bambini in sovrappeso o obesi hanno circa cinque volte più probabilità di essere obesi da adulti, ponendoli a un rischio significativamente maggiore di malattie cardiovascolari, diabete e molte altre comorbidità. Circa il 13,4% dei bambini statunitensi di età compresa tra 2 e 5 anni ha l’obesità1, dimostrando che la tendenza ad accumulare grasso corporeo in eccesso può essere messa in moto molto presto nella vita. Per ragioni molto diverse, l’accumulo di tessuto adiposo in eccesso è una preoccupazione per i polli da carne (tipo carne). I polli da carne moderni sono incredibilmente efficienti ma accumulano ancora più lipidi di quanto sia fisiologicamente necessario 2,3. Questa tendenza inizia subito dopo la schiusa e spreca efficacemente mangime, il componente di produzione più costoso, allocandolo lontano dalla crescita muscolare. Pertanto, sia per i bambini che per i polli da carne, anche se per ragioni molto diverse, è necessario comprendere i fattori che influenzano lo sviluppo del tessuto adiposo e identificare modi per limitare l’espansione adiposa nelle prime fasi della vita.

Gli adipociti si formano dai preadipociti, cellule staminali derivate dal tessuto adiposo che subiscono la differenziazione per sviluppare cellule adipose mature che immagazzinano lipidi. Di conseguenza, i preadipociti in vitro sono un prezioso modello sperimentale per gli studi sull’obesità. Queste cellule, isolate dalla frazione vascolare stromale dei depositi adiposi, possono fornire una comprensione fondamentale delle vie molecolari che controllano la differenziazione degli adipociti e il metabolismo 4,5. Gli embrioni di pulcino sono un modello sperimentale favorevole negli studi sullo sviluppo perché la coltura delle uova secondo il programma desiderato rende più facile la manipolazione sperimentale, in quanto consente di ottenere embrioni senza il sacrificio della madre per osservare una serie di fasi di sviluppo degli embrioni. Inoltre, non sono necessarie complicate procedure chirurgiche e lunghi periodi di tempo per ottenere embrioni rispetto a modelli animali più grandi. Pertanto, l’embrione di pulcino presenta l’opportunità di ottenere preadipociti fin dalle prime fasi dello sviluppo del tessuto adiposo. Il tessuto adiposo sottocutaneo diventa visibile nel pulcino intorno al giorno embrionale 12 (E12) come un deposito chiaramente definito situato intorno alla coscia. Questo deposito è arricchito in preadipociti altamente proliferativi che subiscono attivamente la differenziazione sotto segnali di sviluppo per formare adipociti maturi 6,7. Il processo di differenziazione adipogenica è paragonabile tra polli e umani. Pertanto, i preadipociti isolati da embrioni di pulcino possono essere utilizzati come modello a doppio scopo per studi rilevanti per l’uomo e il pollame. Tuttavia, la resa dei preadipociti diminuisce con l’invecchiamento man mano che le cellule crescono in adipociti maturi5.

Il presente protocollo ottimizza l’isolamento dei preadipociti dal tessuto adiposo durante lo stadio (E16-E18) in cui il differenziamento adipogenico e l’ipertrofia degli adipociti sono al loro apice negli embrioni di pulcino di pollo8. Questa procedura può valutare gli effetti dei fattori a cui l’embrione in via di sviluppo è esposto in ovo, come la dieta della gallina, sullo sviluppo degli adipociti e sul potenziale adipogenico ex vivo. Può anche testare l’impatto di varie manipolazioni (ad esempio, ipossia, aggiunte di nutrienti, agonisti farmacologici e antagonisti) sull’adipogenesi o sui vari ‘omes (ad esempio, trascrittoma, metaboloma, metiloma) dei progenitori degli adipociti. Come rappresentazione del primo stadio della formazione adiposa, le cellule ottenute utilizzando questo protocollo sono modelli preziosi per studi rilevanti per il pollame e l’uomo.

Protocol

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali dell’Università del Tennessee. Le uova di pollo commerciali appena fecondate (Cobb 500) sono state ottenute da un incubatoio locale. Le uova sono state incubate a 38 °C con il 60% di umidità relativa fino alle dissezioni nei giorni embrionali 16-18 (E16-E18). Il tessuto adiposo è stato raccolto dal deposito sottocutaneo (femorale). 1. Preparazione all’isolamento e alla…

Representative Results

I preadipociti primari sono morfologicamente simili ai fibroblasti, con forme irregolari simili a stelle e un nucleo centrale (Figura 2A-C). Le cellule aderiscono prontamente alla plastica di coltura tissutale e iniziano a proliferare subito dopo l’attaccamento. Differenziano e accumulano rapidamente goccioline lipidiche (Figura 3D) quando vengono fornite di acidi grassi nel mezzo. La vitalità (98%, basata sull’esclusione del c…

Discussion

Sebbene diversi protocolli ben descritti abbiano riportato l’isolamento dei preadipociti 14,15,16,17, l’isolamento per i preadipociti embrionali è stato ottimizzato, che può essere utilizzato per analisi funzionali della crescita e dello sviluppo del grasso precoce nei pulcini da carne. Questo protocollo produce progenitori embrionali di adipociti ad alta vitalità con un elevato potenziale d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano UT AgResearch e il Dipartimento di Scienze Animali per aver supportato e ottimizzato questo protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione USDA.

Materials

1 mL Pipette Eppendorf Z683825 Single Channel Pipette, 100 – 1000 µL
1 mL Pipette Tip Fisher Scientific 02-707-402
100% Isopropanol Fisher Scientific A426P4
1x PBS Gibco 10010023
25 mL Flask Pyrex 4980-25
37% Formaldehyde Fisher Scientific F75P-1GAL
6-Well Plate Falcon 353046 Tissue Culture-treated
96-Well Assay Plate Costar 3632
96-Well Plate, Black Bottom Costar 3603 Tissue Culture-treated
AdipoRed Lonza PT-7009
Amphotericin B Gibco 15290026
Bench Top Wiper (Kimtechwiper) Kimberly-Clark 34155
Betadine Up & Up NDC 1167300334 20% Working Solution
Cell Counter Corning 6749
Cell Strainer, 40 µm SPL 93040
Centrifugaton Eppendorf 5702
Chicken Serum Gibco 16110082
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL VWR 10025-690
Conical Centrifuge Tubes, 50 mL Falcon 352098
Cryovial Nunc 343958
Curved Forceps, 100 mm Roboz Surgical RS-5137
Curved Surgical Scissors, 115 mm Roboz Surgical RS-6839
Distilled Water Millipore SYNSV0000 Despensed as needed
DMEM/F12 HyClone SH30023.01
DMSO Sigma D2650
Ethanol Decon Labs 2701 70% Working Solution
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10437028
Fluorescent Microscope Evos M7000
Fluorescent Plate Reader Biotek Synergy H1
Foil Reynolds Reynolds Wrap Heavy Duty Aluminum Foil, 125 SQ. FT.
Freezing Container Thermo Scientific 5100-0001
Gelatin Millipore 4055 2% Working Solution
Hematocytometer (Counting Chamber) Corning 480200 0.1 mm deep
Incubator Fisher Scientific 6845
Instrument Sterilizer VWR B1205
Linoleic Acid-Oleic Acid-Albumin Sigma L9655 1x Working Solution
Microscope Evos AMEX1000
Multi-Channel Pipette Thermo Scientific 4661070 12-Channel Pipetters, 30 – 300 µL
Na2HPO4 Sigma S-7907
NaH2PO4 Sigma S-3139
NucBlue Invitrogen R37605
Oil Red O Sigma O-0625
Orbital Shaker IKA KS130BS1
Paper Towel Tork RK8002
Parafilm Parafilm M PM996
Penicillin/Steptomycin (P/S) Gibco 15140122 1x Working Solution
Petri dishes, 100 mm Falcon 351029
Petri dishes, 60 mm Falcon 351007
Plate Shaker VWR 200
RBC Lysis Buffer Roche 11814389001
Reagent Reservior VWR 89094-680
Small Beaker, 100 mL Pyrex 1000-100
Spectrophotometer Plate Reader Biotek Synergy H1
Sterile Gauze McKesson 762703
Straight Forceps, 120 mm Roboz Surgical RS-4960
Straight Scissors, 140 mm Roboz Surgical RS-6762
T-25 Flask Corning 430639 Tissue Culture-treated
Tissue Culture Incubator Thermo Scientific 50144906
Tissue Strainer, 250 µm Pierce 87791
Trypan Blue Stain Gibco 15250061
Trypsin Gibco 15400054 0.1% Working Solution
Tweezers, 110 mm Roboz Surgical RS-5035
Type 1 Collagenase Gibco 17100017
Water Bath Fisher Scientific 15-462-10
Whatman Grade 1 Filter Paper Whatman 1001-110

References

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Cite This Article
Kim, M., Jung, U., Shepherd, E., Mihelic, R., Voy, B. H. Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos. J. Vis. Exp. (186), e63861, doi:10.3791/63861 (2022).

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