בחינת ההשפעה של חומרי הדברה על נוירונים Caenorhabditis elegans
Summary
בוגרים צעירים Caenorhabditis elegans נמטודות נחשפים לריכוזים שונים של חומרי הדברה מסחריים או חומרים רעילים אחרים במשך 2-24 שעות. לאחר מכן, ניתן לדמיין נוירונים שונים באמצעות זנים המבטאים פלואורסצנטיות. מאמר זה מדגים כיצד לחשוף נמטודות לחומרי הדברה ולהעריך את הנזק לתאי העצב.
Abstract
Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל רב עוצמה המשמש במעבדות מחקר רבות כדי להבין את ההשלכות של חשיפה למזהמים כימיים, חומרי הדברה ומגוון רחב של חומרים רעילים. קל לעבוד עם נמטודות אלה וניתן להשתמש בהן כדי ליצור ממצאי מחקר חדשניים, אפילו במעבדה לביולוגיה לתואר ראשון. סדרה מעבדתית בת מספר שבועות של פרויקטי מחקר אותנטיים, מונחי סטודנטים, מכשירה את התלמידים בארגז כלים של טכניקות וגישות במדידות התנהגותיות, ביולוגיה של התא ומיקרוסקופיה שהם מיישמים לאחר מכן בפרויקטים שלהם. טכניקה אחת בארגז הכלים הזה היא כימות אחוז הנוירונים שמפגינים נזק נוירודגנרטיבי בעקבות חשיפה לחומר רעיל כימי כמו חומר הדברה. נמטודות C. elegans בוגרות צעירות יכולות להיחשף לריכוזים שונים של חומרי הדברה זמינים מסחרית או סוגים אחרים של חומרים רעילים למשך 2-24 שעות. לאחר מכן, סטודנטים לתואר ראשון יכולים לדמיין תתי-סוגים שונים של תאי עצב באמצעות זנים המבטאים פלואורסצנטים של C. elegans. טכניקות אלה אינן דורשות תוכנות עיבוד תמונה מתוחכמות והן יעילות אפילו בהגדלות נמוכות, מה שהופך את הצורך במיקרוסקופיה קונפוקלית יקרה למיותר. מאמר זה מדגים כיצד לטפל בנמטודות באמצעות חומרי הדברה וכיצד לדמות ולדרג את הנוירונים. הוא גם מספק פרוטוקול פשוט למיקרוסקופיה ולניתוח של מורפולוגיה של נוירונים. החומרים המשמשים לטכניקה זו הם זולים וזמינים בקלות ברוב המחלקות לביולוגיה לתואר ראשון. ניתן לשלב טכניקה זו עם מדדים התנהגותיים כמו תנועה, האטה בסיסית או הטלת ביצים כדי לערוך סדרת ניסויים שעשויה להיות ניתנת לפרסום ולהעניק לסטודנטים לתואר ראשון חווית מחקר אותנטית בעלות נמוכה מאוד.
Introduction
Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל מצוין להכשרת קורסי מעבדה בקורסי מדעי הביולוגיה לתלמידי מבוא ובדרג ביניים. הליך מעבדה זה יכול לשמש כחלק ממודול רב-שבועי החוקר השפעות שונות של חומרי הדברה נפוצים על התנהגות C. elegans וביולוגיה של התא. התלמידים יכולים ללמוד כיצד לעצב ולבצע פרויקטים עצמאיים המלמדים אותם ניתוח נתונים ומיומנויות הצגה. מאמר זה מתמקד בפרוטוקולים לחשיפת C. elegans לתערובות חומרי הדברה ולאחר מכן התבוננות וניתוח ההשפעות על המורפולוגיה של נוירונים.
תערובות הדברה כימיות דשא נמצאות בשימוש נרחב למגורים ולחקלאות וניתן לרכוש אותן בכל חנות גינה מקומית. קיים חשש גובר לגבי בטיחותם של כימיקלים אלה עבור בני אדם וחיות בר 1,2,3. התלמידים יכולים לקרוא את הספרות המדעית ולבחור חומר הדברה להערכה ניסויית, ובכך ללמוד על ביולוגיה בסיסית ונוירוביולוגיה, כמו גם על מיומנויות מעבדה חשובות כמו תכנון וניתוח ניסויים, ומיומנויות מעבדה כלליות כמו צנרת ודילולים סדרתיים, מיקרוסקופיה ניתוחית, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, צילום דיגיטלי וייצור דמויות.
הפרוטוקולים המתוארים במאמר זה יכולים לעמוד בפני עצמם בקורס ברמה בינונית בביולוגיה או במדעי המוח או להיות חלק ממודול רב-שבועי שיכול לכלול גם מדידות של התנהגויות הנשלטות על ידי קבוצות מסוימות של נוירונים. לדוגמה, המתואר בפרוטוקול זה הוא הערכה של המורפולוגיה של נוירונים כולינרגיים השולטים בתנועה באמצעות זן של נמטודה המבטאת GFP (LX 929) בתאי עצב כולינרגיים4. זנים אלה ניתן להשיג במחירים נמוכים מאוד ממרכז הגנטיקה של Caenorhabditis elegans (https://cgc.umn.edu/). זנים המבטאים GFP בתאי עצב דופמינרגיים (OH 7457), נוירונים כולינרגיים (LX 929) או mCherry המתבטאים בכל תאי העצב (PVX4) הם כולם בחירות טובות. התלמידים יכלו גם למדוד תנועה ולקבל נתונים שילוו את הערכת המורפולוגיה. תיאור מלא של פרויקט קבוצת סטודנטים רב-שבועית ניתן למצוא בסוסמן5.
פרויקט זה של קבוצת סטודנטים הוא די זול וקל להתקנה לקבוצות של ארבעה תלמידים. החומרים הדרושים כוללים מיקרוסקופ מנתח, גישה למיקרוסקופ תרכובת פלואורסצנטית שיכולה להכיל מצלמה דיגיטלית מחוברת, לוחות פטרי וגישה לאגר גדילת נמטודות, חיידקים מוגבלי גדילה (זן OP50, מה- CGC), מבער בונזן להבת גז או מנורת אלכוהול, אוטוקלאב, חוט פלטינה, ואספקת מעבדה כללית כמו מיקרופיפטרים, מגלשות מיקרוסקופ, כיסויים, ופיפטות פסטר זכוכית. בהתאם לרעלן הכימי שנבדק על ידי קבוצות התלמידים, ייתכן שהשלבים בפרוטוקול יצטרכו להתרחש מתחת למכסה אדים או עם כפפות. פרוטוקול זה משתמש בתערובות כימיות מסיסות במים (לא נדיפות), וכל נהלי הטיפול הבטוח המומלצים על ידי היצרן מתבצעים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקולים המתוארים בכתב יד זה פועלים בהצלחה לבדה או כחלק מפרויקט של קבוצת סטודנטים עצמאית רב-שבועית. הפרוטוקולים נוחים גם לחוויות חקירה עצמאיות של שבוע אחד. זני הנמטודות זולים וקלים לתחזוקה במעבדת המחקר. התלמידים יכולים ללמוד בקלות כיצד לקטוף תולעים עם קטיף תולעים או כיצד להזיז אותן על…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה המתוארת בכתב יד זה נעשתה עבור כיתה ברמה בינונית במדעי המוח. הכספים לריאגנטים ולאספקה סופקו על ידי המחלקה לביולוגיה במכללת ואסאר. המיקרוסקופים ומערכת ההדמיה הדיגיטלית סופקו גם על ידי המחלקה לביולוגיה במכללת ואסאר. המחבר מודה לכל התלמידים הרבים שלקחו את הקורס הזה.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP97445 | |
| Agarose | Fisher Scientific | MP1AGAH0250 | |
| Alcohol lamp | Fisher Scientific | 17012826 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 17-012-820 | |
| C. elegans strains | C. elegans Genetics Center | ||
| CaCl | Fisher Scientific | 10035-04-8 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | AAA1147030 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-AP | |
| Digital camera | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| E. coli strain (OP50) | C. elegans Genetics Center | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Fluorescent scope | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Imaging software | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Inoculation loop | Fisher Scientific | 131045 | |
| LB Broth Base | Fisher Scientific | BP9723-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05408129 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-265446 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 94060316 | |
| Pipetters | Fisher Scientific | 14-386-319 | |
| Platinum wire | Genesee Scientific | 59-1M30P | |
| Potassium Phosphate buffer | Fisher Scientific | AAJ61413AP | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | AC447810250 |
References
- Duzguner, V., Erdogan, S. Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver & central nervous system of rats. Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).
- Catae, A. F., et al. Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae). Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).
- Bradford, B. R., Whidden, E., Gervasio, E. D., Checchi, P. M., Raley-Susman, K. M. Neonicotinoid-containing insecticide disruption of growth, locomotion, and fertility in Caenorhabditis elegans. PLOS One. 15 (9), 0238637 (2020).
- Jospin, M., et al. A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 7 (12), 1000265 (2009).
- Susman, K. . Discovery-Based Learning in the Life Sciences. , (2015).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Brody, H. A., Chou, E., Gray, J. M., Pokyrwka, N. J., Raley-Susman, K. M. Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration. NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).
- Chen, P., Martinez-Finley, E. J., Bornhorst, J., Chakraborty, S., Aschner, M. Metal-induced neurodegeneration in C. elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 5, (2013).
- Hart, A. Behavior. WormBook. , (2006).
- Harlow, P. H., et al. The nematode Caenorhabditis elegans as a tool to predict chemical activity on mammalian development and identify mechanisms influencing toxicological outcome. Scientific Reports. 6 (1), 22965 (2016).
