Examinando el efecto de los pesticidas en las neuronas caenorhabditis elegans
Summary
Los nematodos Caenorhabditis elegans adultos jóvenes están expuestos a diferentes concentraciones de pesticidas comerciales u otros tóxicos durante 2-24 h. Luego, se pueden visualizar diferentes neuronas utilizando cepas que expresan fluorescentes. Este artículo demuestra cómo exponer los nematodos a los pesticidas y evaluar el daño neuronal.
Abstract
Caenorhabditis elegans es un poderoso organismo modelo utilizado en muchos laboratorios de investigación para comprender las consecuencias de la exposición a contaminantes químicos, pesticidas y una amplia variedad de sustancias tóxicas. Estos nematodos son fáciles de trabajar y se pueden utilizar para generar nuevos hallazgos de investigación, incluso en el laboratorio de biología de pregrado. Una serie de laboratorios de varias semanas de proyectos de investigación auténticos e impulsados por los estudiantes capacita a los estudiantes en un conjunto de técnicas y enfoques en mediciones de comportamiento, biología celular y microscopía que luego aplican a sus proyectos. Una técnica en ese conjunto de herramientas es cuantificar el porcentaje de neuronas que exhiben daño neurodegenerativo después de la exposición a un tóxico químico como un pesticida. Los nematodos de C. elegans adultos jóvenes pueden estar expuestos a diferentes concentraciones de pesticidas u otros tipos de tóxicos disponibles comercialmente durante 2-24 h. Luego, los estudiantes de pregrado pueden visualizar diferentes subtipos de neuronas utilizando cepas de C. elegans que expresan fluorescentes. Estas técnicas no requieren un sofisticado software de procesamiento de imágenes y son efectivas incluso a bajos aumentos, lo que hace innecesaria la necesidad de una costosa microscopía confocal. Este artículo demuestra cómo tratar los nematodos con pesticidas y cómo obtener imágenes y puntuar las neuronas. También proporciona un protocolo sencillo para la microscopía y el análisis de la morfología neuronal. Los materiales utilizados para esta técnica son baratos y fácilmente disponibles en la mayoría de los departamentos de biología de pregrado. Esta técnica se puede combinar con medidas de comportamiento como la locomoción, la desaceleración basal o la puesta de huevos para llevar a cabo una serie de experimentos potencialmente publicables y brindar a los estudiantes de pregrado una experiencia de investigación auténtica a un costo muy bajo.
Introduction
Caenorhabditis elegans es un excelente organismo modelo para la formación de cursos de laboratorio en cursos de ciencias biológicas para estudiantes de nivel introductorio e intermedio. Este procedimiento de laboratorio se puede utilizar como parte de un módulo de varias semanas que explora varios efectos de los pesticidas de uso común en el comportamiento de C. elegans y la biología celular. Los estudiantes pueden aprender a diseñar y llevar a cabo proyectos independientes que les enseñen habilidades de análisis de datos y presentación. Este artículo se centra en los protocolos para exponer A. elegans a mezclas de pesticidas y luego observar y analizar los efectos sobre la morfología neuronal.
Las mezclas de pesticidas químicos para césped son ampliamente utilizadas para uso residencial y agrícola y se pueden comprar en cualquier tienda de jardinería local. Existe una creciente preocupación por la seguridad de estos productos químicos para los seres humanos y la vida silvestre 1,2,3. Los estudiantes pueden leer la literatura científica y seleccionar un pesticida para la evaluación experimental y, al hacerlo, pueden aprender sobre biología básica y neurobiología, así como importantes habilidades de laboratorio como diseño y análisis experimental, y habilidades generales de laboratorio como pipeteo y diluciones en serie, microscopía de disección, microscopía fluorescente, fotografía digital y producción de figuras.
Los protocolos descritos en este artículo pueden ser independientes en un curso de nivel intermedio en biología o neurociencia o ser parte de un módulo de varias semanas que también podría incluir mediciones de comportamientos gobernados por grupos particulares de neuronas. Por ejemplo, se describe en este protocolo una evaluación de la morfología de las neuronas colinérgicas que gobiernan la locomoción utilizando una cepa de nematodo que expresa GFP (LX 929) en las neuronas colinérgicas4. Estas cepas se pueden obtener a precios muy bajos en el Centro de Genética Caenorhabditis elegans (https://cgc.umn.edu/). Las cepas que expresan GFP en neuronas dopaminérgicas (OH 7457), neuronas colinérgicas (LX 929) o mCherry expresadas en todas las neuronas (PVX4) son buenas opciones. Los estudiantes también podrían medir la locomoción y obtener datos para acompañar la evaluación de la morfología. Una descripción completa de un proyecto de grupo de estudiantes de varias semanas se puede encontrar en Susman5.
Este proyecto de grupo de estudiantes es bastante económico y fácil de configurar para grupos de cuatro estudiantes. Los materiales necesarios incluyen un microscopio de disección, acceso a un microscopio compuesto de fluorescencia que puede tener una cámara digital adjunta, placas de Petri y acceso a agar de crecimiento de nematodos, bacterias de crecimiento limitado (cepa OP50, del CGC), un quemador Bunsen de llama de gas o una lámpara de alcohol, un autoclave, alambre de platino y suministros generales de laboratorio como micropipetas, portaobjetos de microscopio, fundas, y pipetas Pasteur de vidrio. Dependiendo del tóxico químico que estén examinando los grupos de estudiantes, los pasos en el protocolo pueden necesitar ocurrir bajo una campana de humos o con guantes. Este protocolo utiliza mezclas químicas que son solubles en agua (no volátiles), y se siguen todos los procedimientos de manejo seguro recomendados por el fabricante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los protocolos descritos en este manuscrito funcionan con éxito solos o como parte de un proyecto de grupo de estudiantes independiente de varias semanas. Los protocolos también son susceptibles de experiencias exploratorias independientes de una semana. Las cepas de nematodos son baratas y fáciles de mantener en el laboratorio de investigación. Los estudiantes pueden aprender fácilmente cómo recoger gusanos con un pico de gusano o cómo moverlos enjuagando las placas con agua y permitiéndoles asentarse por graved…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo descrito en este manuscrito se realizó para una clase de nivel intermedio en neurociencia. Los fondos para los reactivos y suministros fueron proporcionados por el Departamento de Biología de Vassar College. Los microscopios y el sistema de imágenes digitales también fueron proporcionados por el Departamento de Biología de Vassar College. El autor agradece a todos los muchos estudiantes que tomaron este curso.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP97445 | |
| Agarose | Fisher Scientific | MP1AGAH0250 | |
| Alcohol lamp | Fisher Scientific | 17012826 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 17-012-820 | |
| C. elegans strains | C. elegans Genetics Center | ||
| CaCl | Fisher Scientific | 10035-04-8 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | AAA1147030 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-AP | |
| Digital camera | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| E. coli strain (OP50) | C. elegans Genetics Center | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Fluorescent scope | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Imaging software | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Inoculation loop | Fisher Scientific | 131045 | |
| LB Broth Base | Fisher Scientific | BP9723-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05408129 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-265446 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 94060316 | |
| Pipetters | Fisher Scientific | 14-386-319 | |
| Platinum wire | Genesee Scientific | 59-1M30P | |
| Potassium Phosphate buffer | Fisher Scientific | AAJ61413AP | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | AC447810250 |
References
- Duzguner, V., Erdogan, S. Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver & central nervous system of rats. Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).
- Catae, A. F., et al. Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae). Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).
- Bradford, B. R., Whidden, E., Gervasio, E. D., Checchi, P. M., Raley-Susman, K. M. Neonicotinoid-containing insecticide disruption of growth, locomotion, and fertility in Caenorhabditis elegans. PLOS One. 15 (9), 0238637 (2020).
- Jospin, M., et al. A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 7 (12), 1000265 (2009).
- Susman, K. . Discovery-Based Learning in the Life Sciences. , (2015).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Brody, H. A., Chou, E., Gray, J. M., Pokyrwka, N. J., Raley-Susman, K. M. Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration. NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).
- Chen, P., Martinez-Finley, E. J., Bornhorst, J., Chakraborty, S., Aschner, M. Metal-induced neurodegeneration in C. elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 5, (2013).
- Hart, A. Behavior. WormBook. , (2006).
- Harlow, P. H., et al. The nematode Caenorhabditis elegans as a tool to predict chemical activity on mammalian development and identify mechanisms influencing toxicological outcome. Scientific Reports. 6 (1), 22965 (2016).
