دراسة تأثير المبيدات الحشرية على الخلايا العصبية Caenorhabditis elegans
Summary
تتعرض الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans البالغة لتركيزات مختلفة من المبيدات التجارية أو غيرها من المواد السامة لمدة 2-24 ساعة. بعد ذلك ، يمكن تصور الخلايا العصبية المختلفة باستخدام سلالات التعبير عن الفلورسنت. توضح هذه الورقة كيفية تعريض الديدان الخيطية للمبيدات الحشرية وتقييم تلف الخلايا العصبية.
Abstract
Caenorhabditis elegans هو كائن حي نموذجي قوي يستخدم في العديد من مختبرات الأبحاث لفهم عواقب التعرض للملوثات الكيميائية والمبيدات الحشرية ومجموعة واسعة من المواد السامة. هذه الديدان الخيطية سهلة الاستخدام ويمكن استخدامها لتوليد نتائج بحثية جديدة ، حتى في مختبر البيولوجيا الجامعي. تقوم سلسلة مختبرية متعددة الأسابيع من المشاريع البحثية الأصيلة التي يحركها الطلاب بتدريب الطلاب على مجموعة أدوات من التقنيات والنهج في القياسات السلوكية وبيولوجيا الخلية والفحص المجهري التي يطبقونها بعد ذلك على مشاريعهم. إحدى التقنيات في مجموعة الأدوات هذه هي تحديد النسبة المئوية للخلايا العصبية التي تظهر أضرارا تنكسية عصبية بعد التعرض لمادة كيميائية سامة مثل مبيد حشري. يمكن أن تتعرض الديدان الخيطية C. elegans البالغة من الشباب لتركيزات مختلفة من المبيدات الحشرية المتاحة تجاريا أو أنواع أخرى من المواد السامة لمدة 2-24 ساعة. بعد ذلك ، يمكن للطلاب الجامعيين تصور أنواع فرعية مختلفة من الخلايا العصبية باستخدام سلالات التعبير عن الفلورسنت من C. elegans. لا تتطلب هذه التقنيات برامج متطورة لمعالجة الصور وهي فعالة حتى في التكبيرات المنخفضة ، مما يجعل الحاجة إلى الفحص المجهري البؤري المكلف غير ضرورية. توضح هذه الورقة كيفية علاج الديدان الخيطية بالمبيدات الحشرية وكيفية تصوير الخلايا العصبية وتسجيلها. كما يوفر بروتوكولا مباشرا للفحص المجهري وتحليل مورفولوجيا الخلايا العصبية. المواد المستخدمة لهذه التقنية غير مكلفة ومتاحة بسهولة في معظم أقسام البيولوجيا الجامعية. يمكن الجمع بين هذه التقنية والتدابير السلوكية مثل الحركة أو التباطؤ القاعدي أو وضع البيض لإجراء سلسلة من التجارب التي يمكن نشرها وإعطاء طلاب البكالوريوس تجربة بحثية حقيقية بتكلفة منخفضة للغاية.
Introduction
Caenorhabditis elegans هو كائن حي نموذجي ممتاز للتدريب على الدورات المختبرية في دورات العلوم البيولوجية لطلاب المستوى التمهيدي والمتوسط. يمكن استخدام هذا الإجراء المختبري كجزء من وحدة متعددة الأسابيع تستكشف الآثار المختلفة للمبيدات الحشرية شائعة الاستخدام على سلوك C. elegans وبيولوجيا الخلية. يمكن للطلاب تعلم كيفية تصميم وتنفيذ مشاريع مستقلة تعلمهم مهارات تحليل البيانات والعرض. تركز هذه الورقة على بروتوكولات تعريض C. elegans لمخاليط المبيدات الحشرية ثم مراقبة وتحليل التأثيرات على مورفولوجيا الخلايا العصبية.
تستخدم مخاليط مبيدات الآفات الكيميائية في الحديقة على نطاق واسع للاستخدام السكني والزراعي ويمكن شراؤها من أي متجر حديقة محلي. هناك قلق متزايد بشأن سلامة هذه المواد الكيميائية للبشر والحياة البرية1،2،3. يمكن للطلاب قراءة الأدبيات العلمية واختيار مبيد للآفات للتقييم التجريبي ، وبذلك ، يمكنهم التعرف على البيولوجيا الأساسية والبيولوجيا العصبية ، بالإضافة إلى المهارات المختبرية المهمة مثل التصميم التجريبي والتحليل ، ومهارات المختبر العامة مثل السحب والتخفيفات التسلسلية ، وتشريح المجهر ، والمجهر الفلورسنت ، والتصوير الرقمي ، وإنتاج الأرقام.
يمكن أن تكون البروتوكولات الموصوفة في هذه الورقة قائمة بذاتها في دورة متوسطة المستوى في علم الأحياء أو علم الأعصاب أو أن تكون جزءا من وحدة متعددة الأسابيع يمكن أن تشمل أيضا قياسات للسلوكيات التي تحكمها مجموعات معينة من الخلايا العصبية. على سبيل المثال ، الموصوف في هذا البروتوكول هو تقييم لمورفولوجيا الخلايا العصبية الكولينية التي تحكم الحركة باستخدام سلالة من الديدان الخيطية التي تعبر عن GFP (LX 929) في الخلايا العصبية الكولينية4. يمكن الحصول على هذه السلالات بأسعار منخفضة للغاية من مركز Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/). السلالات التي تعبر عن GFP في الخلايا العصبية الدوبامينية (OH 7457) أو الخلايا العصبية الكولينية (LX 929) أو mCherry المعبر عنها في جميع الخلايا العصبية (PVX4) كلها خيارات جيدة. يمكن للطلاب أيضا قياس الحركة والحصول على بيانات لمرافقة تقييم المورفولوجيا. يمكن العثور على وصف كامل لمشروع مجموعة طلابية لعدة أسابيع في Susman5.
مشروع مجموعة الطلاب هذا غير مكلف للغاية وسهل الإعداد لمجموعات من أربعة طلاب. وتشمل المواد اللازمة مجهر تشريح ، والوصول إلى المجهر المركب الفلوري الذي يمكن أن يحتوي على كاميرا رقمية مرفقة ، وألواح بتري والوصول إلى أجار نمو الديدان الخيطية ، والبكتيريا المحدودة النمو (سلالة OP50 ، من CGC) ، وموقد بنسن لهب الغاز أو مصباح الكحول ، والأوتوكلاف ، والأسلاك البلاتينية ، ولوازم المختبرات العامة مثل الماصة الدقيقة ، وشرائح المجهر ، أغطية ، وماصات باستور الزجاجية. اعتمادا على المادة السامة الكيميائية التي يتم فحصها من قبل مجموعات الطلاب ، قد تحتاج الخطوات الواردة في البروتوكول إلى أن تحدث تحت غطاء الدخان أو مع القفازات. يستخدم هذا البروتوكول مخاليط كيميائية قابلة للذوبان في الماء (غير متقلبة) ، ويتم اتباع جميع إجراءات المناولة الآمنة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعمل البروتوكولات الموضحة في هذه المخطوطة بنجاح بمفردها أو كجزء من مشروع مجموعة طلابية مستقلة لعدة أسابيع. كما أن البروتوكولات قابلة للتجارب الاستكشافية المستقلة لمدة أسبوع واحد. سلالات الديدان الخيطية رخيصة وسهلة الصيانة في مختبر البحوث. يمكن للطلاب بسهولة تعلم كيفية اختيار الديدان با…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم إنجاز العمل الموصوف في هذه المخطوطة لفئة متوسطة المستوى في علم الأعصاب. تم توفير الأموال للكواشف واللوازم من قبل قسم البيولوجيا في كلية فاسار. كما تم توفير المجاهر ونظام التصوير الرقمي من قبل قسم البيولوجيا في كلية فاسار. يشكر المؤلف جميع الطلاب العديدين الذين أخذوا هذه الدورة.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP97445 | |
| Agarose | Fisher Scientific | MP1AGAH0250 | |
| Alcohol lamp | Fisher Scientific | 17012826 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 17-012-820 | |
| C. elegans strains | C. elegans Genetics Center | ||
| CaCl | Fisher Scientific | 10035-04-8 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | AAA1147030 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-AP | |
| Digital camera | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| E. coli strain (OP50) | C. elegans Genetics Center | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Fluorescent scope | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Imaging software | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Inoculation loop | Fisher Scientific | 131045 | |
| LB Broth Base | Fisher Scientific | BP9723-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05408129 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-265446 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 94060316 | |
| Pipetters | Fisher Scientific | 14-386-319 | |
| Platinum wire | Genesee Scientific | 59-1M30P | |
| Potassium Phosphate buffer | Fisher Scientific | AAJ61413AP | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | AC447810250 |
References
- Duzguner, V., Erdogan, S. Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver & central nervous system of rats. Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).
- Catae, A. F., et al. Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae). Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).
- Bradford, B. R., Whidden, E., Gervasio, E. D., Checchi, P. M., Raley-Susman, K. M. Neonicotinoid-containing insecticide disruption of growth, locomotion, and fertility in Caenorhabditis elegans. PLOS One. 15 (9), 0238637 (2020).
- Jospin, M., et al. A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 7 (12), 1000265 (2009).
- Susman, K. . Discovery-Based Learning in the Life Sciences. , (2015).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Brody, H. A., Chou, E., Gray, J. M., Pokyrwka, N. J., Raley-Susman, K. M. Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration. NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).
- Chen, P., Martinez-Finley, E. J., Bornhorst, J., Chakraborty, S., Aschner, M. Metal-induced neurodegeneration in C. elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 5, (2013).
- Hart, A. Behavior. WormBook. , (2006).
- Harlow, P. H., et al. The nematode Caenorhabditis elegans as a tool to predict chemical activity on mammalian development and identify mechanisms influencing toxicological outcome. Scientific Reports. 6 (1), 22965 (2016).
