Uma abordagem baseada em espectrometria de massa para identificar fosfofamina fosfates e seus interacttores

A fosforilação proteica controla a maioria dos processos celulares, incluindo, mas não se limitando à resposta a danos no DNA, sinalização de fator de crescimento e a passagem pela mitose ^1,2,3. Em células de mamíferos, a maioria das proteínas são fosfoiladas em um ou mais resíduos de soro, threonina ou tyrosina em algum momento, com fosfoserinas e fosfothreoninas compreendendo aproximadamente 98% de todos os locais de fosforilação ^2,3. Embora as cinesases tenham sido extensivamente estudadas na sinalização celular, o papel das PPPs na regulação de processos celulares dinâmicos ainda está surgindo.

A dinâmica da fosforilação é controlada pela interação dinâmica entre quinases e fosfates. Nas células mamíferas, existem mais de 400 quinases proteicas que catalisam a fosforilação serina/threonina. Mais de 90% desses locais são desfosforilados por fosfoproteínas (PPPs), uma pequena família de enzimas que consiste em PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT e PPZ ^2,3. PP1 e PP2A são responsáveis pela maioria da fosfoserina e fosfotoreonina desfosforilação dentro de uma célula ^2,3,4. A notável diferença de número entre quinases e fosfattases e a falta de especificidade das subunidades catalíticas PPP in vitro levaram à crença de que as quinases são o principal determinante da fosforilação ^2,3. No entanto, vários estudos mostraram fosfatidades para estabelecer especificidade de substrato através da formação de holoenzimas multimédicos 5,6,7,8,9. Por exemplo, o PP1 é um heterodimer que consiste em uma subunidade catalítica e, em um dado momento, uma das mais de 150 subunidades regulatórias ^6,7,8. Por outro lado, PP2A é um heterotrimer que é formado por andaimes (A), um regulador (B) e uma subunidade catalítica (C) ^2,3,9. Existem quatro famílias distintas de subunidades regulatórias PP2A (B55, B56, PR72 e striatina), cada uma com múltiplos genes, variantes de emenda e padrões de localização ^2,3,9. A natureza multimérica das PPPs preenche a lacuna no número de quinases e subunidades catalíticas PPP. No entanto, cria desafios analíticos para o estudo da sinalização PPP. Para analisar de forma abrangente a sinalização PPP, é fundamental investigar as várias holoenzimias dentro de uma célula ou tecido. Grandes avanços foram feitos no estudo do kinome humano através do uso de contas inibidoras de quinase, denominadas contas inibidoras multiplex ou kinobeads, uma estratégia proteômica química onde os inibidores da quinase são imobilizados em contas e espectrometria de massa é usado para identificar quinases enriquecidas e seus interageres 10,11,12,13.

Estabelecemos uma abordagem semelhante para estudar biologia ppp. Esta técnica envolve a captura de afinidade de subunidades catalíticas PPP utilizando contas com um inibidor ppp imobilizado e não seletivo chamado microcistina-LR (MCLR) chamado de contas inibidoras de fosfatase (PIBs)^14,15. Ao contrário de outros métodos que requerem a marcação endógena ou expressão de subunidades exógenas de PPP que poderiam alterar a atividade ou localização da proteína, o PIB-MS permite o enriquecimento de subunidades catatróticas PPP endógenas, suas subunidades regulatórias e andaimes associadas, e proteínas interativas (denominadas PPPome) a partir de células e tecidos em um determinado ponto de tempo ou sob condições específicas de tratamento. A MCLR inibe pp1, PP2A, PP4-6, PPT e PPZ em concentrações de nanomolar, tornando os PIBs altamente eficazes no enriquecimento para o PPPome¹⁶. Este método pode ser dimensionado para uso em qualquer material inicial de células para amostras clínicas. Aqui, descrevemos em detalhes o uso de PIBs e espectrometria de massa (PIB-MS) para capturar, identificar e quantificar eficientemente o PPPome endógeno e seus estados de modificação.

Figura 1: Resumo visual do protocolo PIB-MS. Em um experimento PIB-MS, as amostras podem ser obtidas de várias formas, desde células até tumores. A amostra é coletada, líseda e homogeneizada antes do enriquecimento de PPP. Para enriquecer para PPPs, o lysate é incubado com PIBs com ou sem um inibidor de PPP, como o MCLR. Os PIBs são então lavados, e as PPPs são elucidadas em condições de desnaturação. As amostras são preparadas para análise de espectrometria de massa pela remoção de detergentes através do enriquecimento de proteína SP3, digestão tripptica e dessalção. As amostras podem então ser rotuladas opcionalmente de TMT antes da análise de espectrometria de massa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O PIB-MS envolve lise e esclarecimento de células ou tecidos, incubação do lysate com PIBs, elução e análise do elunato por meio de manchas ocidentais ou abordagens baseadas em espectrometria de massa (Figura 1). A adição de MCLR gratuito pode ser usada como um controle para distinguir aglutinantes PIB específicos de interagidores não específicos. Para a maioria das aplicações, uma abordagem sem rótulos pode ser usada para identificar diretamente proteínas em eluatos. Nos casos em que é necessária maior precisão na quantificação ou identificação de espécies de baixa abundância, o processamento posterior com rotulagem tandem mass tag (TMT) pode ser usado para aumentar a cobertura e diminuir a entrada.