Масс-спектрометрический подход к идентификации фосфопротеинфосфатаз и их интеракторов
Summary
Здесь мы представляем протокол обогащения эндогенных фосфопротеинфосфатаз и их взаимодействующих белков из клеток и тканей, а также их идентификацию и количественную оценку с помощью протеомики на основе масс-спектрометрии.
Abstract
Большинство клеточных процессов регулируются динамическим фосфорилированием белка. Более трех четвертей белков фосфорилируются, а фосфопротеинфосфатазы (ППС) координируют более 90% всего клеточного серо/треонина дефосфорилирования. Дерегуляция фосфорилирования белка была вовлечена в патофизиологию различных заболеваний, включая рак и нейродегенерацию. Несмотря на широкую активность, молекулярные механизмы, контролирующие ПГЧС, и механизмы, контролируемые ПГЧС, плохо характеризуются. Здесь описан протеомный подход, называемый шариками ингибитора фосфатазы и масс-спектрометрией (PIB-MS), для идентификации и количественной оценки ППС, их посттрансляционных модификаций и их интеракторов всего за 12 ч с использованием любой клеточной линии или ткани. PIB-MS использует неселективный ингибитор PPP, микроцистин-LR (MCLR), иммобилизованный на шариках сефарозы для захвата и обогащения эндогенных PPP и связанных с ними белков (называемых PPPome). Этот метод не требует экзогенной экспрессии помеченных версий PPP или использования специфических антител. PIB-MS предлагает инновационный способ изучения эволюционно сохраненных ГЧП и расширения нашего нынешнего понимания сигнализации дефосфорилирования.
Introduction
Фосфорилирование белка контролирует большинство клеточных процессов, включая, но не ограничиваясь, реакцией на повреждение ДНК, передачей сигналов фактора роста и прохождением через митоз 1,2,3. В клетках млекопитающих большинство белков фосфорилируются в одном или нескольких остатках серина, треонина или тирозина в какой-то момент времени, причем фосфосерины и фосфотреонины составляют примерно 98% всех участков фосфорилирования 2,3. Хотя киназы широко изучаются в клеточной сигнализации, роль ПГЧС в регуляции динамических клеточных процессов все еще вырисовывается.
Динамика фосфорилирования контролируется динамическим взаимодействием между киназами и фосфатазами. В клетках млекопитающих насчитывается более 400 протеинкиназ, которые катализируют фосфорилирование серина/треонина. Более 90% этих участков дефосфорилируются фосфопротеинфосфатазами (ППС), небольшим семейством ферментов, которое состоит из PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT и PPZ 2,3. PP1 и PP2A ответственны за большую часть дефосфосерина и фосфотреонина в клетке 2,3,4. Заметная разница в количестве между киназами и фосфатазами и отсутствие специфичности каталитических субъединиц ППС in vitro привели к убеждению, что киназы являются основным детерминантом фосфорилирования 2,3. Однако многочисленные исследования показали, что фосфатазы устанавливают субстратную специфичность за счет образования многомерных голоферментов 5,6,7,8,9. Например, PP1 представляет собой гетеродимер, который состоит из каталитической субъединицы и, в данный момент времени, одной из более чем 150 регуляторных субъединиц 6,7,8. И наоборот, PP2A представляет собой гетеротример, который образован из строительных лесов (A), регулятора (B) и каталитической (C) субъединицы 2,3,9. Существует четыре различных семейства регуляторных субъединиц PP2A (B55, B56, PR72 и стриатин), каждое из которых имеет несколько генов, вариантов сращивания и паттернов локализации 2,3,9. Многомерный характер ПГЧС заполняет пробел в количестве киназ и каталитических субъединиц ППС. Однако это создает аналитические проблемы для изучения сигнализации ГЧП. Чтобы всесторонне проанализировать передачу сигналов ППС, крайне важно исследовать различные голоферменты в клетке или ткани. Большие успехи были достигнуты в изучении человеческого кинома благодаря использованию шариков ингибитора киназы, называемых бусинами мультиплексных ингибиторов или кинобеодами, химической протеомной стратегии, в которой ингибиторы киназы иммобилизуются на шариках, а масс-спектрометрия используется для идентификации обогащенных киназ и их интеракторов 10,11,12,13.
Мы установили аналогичный подход к изучению биологии ГЧП. Этот метод включает в себя захват аффинности каталитических субъединиц ППС с использованием шариков с иммобилизованным, неселективным ингибитором ППС, называемым микроцистином-LR (MCLR), называемым шариками ингибитора фосфатазы (PIBs)14,15. В отличие от других способов, требующих эндогенной маркировки или экспрессии экзогенных субъединиц ППС, которые могут изменять активность или локализацию белка, PIB-MS позволяет обогащать эндогенные каталитические субъединицы ППС, связанные с ними регуляторные и каркасные субъединицы, а также взаимодействующие белки (называемые PPPome) из клеток и тканей в данный момент времени или при определенных условиях обработки. MCLR ингибирует PP1, PP2A, PP4-6, PPT и PPZ в наномолярных концентрациях, что делает PIB высокоэффективными при обогащении PPPome16. Этот метод может быть масштабирован для использования на любом исходном материале от клеток до клинических образцов. Здесь мы подробно описываем использование PIB и масс-спектрометрии (PIB-MS) для эффективного захвата, идентификации и количественной оценки эндогенного PPPome и его модифицирующих состояний.
Рисунок 1: Визуальная сводка протокола PIB-MS. В эксперименте PIB-MS образцы могут быть получены в различных формах, от клеток до опухолей. Образец собирается, лизируется и гомогенизируется перед обогащением ППС. Для обогащения для ПГЧС лизат инкубируют с ПИБ с ингибитором ППС или без него, таким как MCLR. Затем ПИБ промывают, а ПГЧС элюируют в условиях денатурации. Образцы подготавливаются для масс-спектрометрического анализа путем удаления моющих средств путем обогащения белка SP3, триптического сбраживания и обессоливания. Затем образцы могут быть опционально помечены TMT перед масс-спектрометрическим анализом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
PIB-MS включает лизис и осветление клеток или тканей, инкубацию лизата с PIB, элюирование и анализ элюата с помощью подходов, основанных на вестерн-блоттинге или масс-спектрометрии (рисунок 1). Добавление свободного MCLR может быть использовано в качестве элемента управления для различения конкретных связующих PIB от неспецифических интеракторов. Для большинства применений подход без маркировки может быть использован для непосредственной идентификации белков в элюатах. В тех случаях, когда требуется более высокая точность количественной оценки или идентификация видов с низкой численностью, для увеличения охвата и уменьшения вводимых ресурсов может использоваться дальнейшая обработка с помощью маркировки тандемной массы (ТМТ).
Protocol
Representative Results
Discussion
PIB-MS – это химический протеомический подход, используемый для количественного профилирования PPPome из различных источников образцов в одном анализе. Большая работа была проделана с использованием шариков ингибитора киназы для изучения кинома и того, как он изменяется при раке и других б?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.N.K. признает поддержку со стороны NIH R33 CA225458 и R35 GM119455. Мы благодарим лаборатории Кеттенбаха и Гербера за их полезную дискуссию.
Materials
| Acetonitrile (ACN) | Honeywell | AH015-4 | CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood. |
| Anhydrous Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | CAUTION: ACN is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood. |
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | model no. 5424 | |
| Beta-glycerophosphoric acid, disodium salt pentahydrate | Acros Organics | 410991000 | |
| Centrifuge | Eppendorf | model no. 5810 R 15 amp version | |
| Distilled water | |||
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Dounce tissue grinder | Fisherbrand Pellet Pestles | 12-141-363 | |
| Empore solid phase extraction disk, C18 | CDS Analytical | 76333-132 | |
| Eppendorf tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis. |
| Eppendorf tubes, 2 mL | Eppendorf | 22363352 | CRITICAL: Other tubes may leach polymer into sample, contaminating the analysis. |
| Extraction plate manifold | Waters | WAT097944 | |
| Falcon tubes, 50 mL | VWR | 21008 | |
| Generic blunt end needle and plunger | |||
| Generic magnetic separation rack | |||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen chloride (HCl) | VWR Chemicals BDH | BDH3028 | CAUTION: HCl is corrosive; wear gloves and work in a chemical fume hood. |
| Hydroxylamine solution 50% (wt/vol) | Sigma-Aldrich | 467804 | |
| Incubator, 65 °C | VWR | model no. 1380FM | |
| Koptec Pure Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | V1001 | |
| Methanol for HPLC (MeOH) | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CAUTION: MeOH is flammable and toxic; wear gloves, and work in a chemical fume hood. |
| Microcystin LR (MCLR) | Cayman Chemical | 10007188 | CAUTION: MCLR is toxic; wear gloves when handling and avoid skin contact. |
| PBS, 1× without calcium and magnesium, pH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | |
| pH test strips, such as MilliporeSigma MColorpHast pH test strips and indicator papers | Fisher Scientific | M1095310001 | |
| PIBs | For protocol for the generation of PIBs, see Moorhead et al., 2007. | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pipette tips, 10 μL | Eppendorf | 22491504 | CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis. |
| Pipette tips, 1000 μL | Eppendorf | 22491555 | CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis. |
| Pipette tips, 200 μL | Eppendorf | 22491539 | CRITICAL: Other tips may leach polymer into samples, contaminating the analysis. |
| plastic syringe, 10 mL | BD | 309604 | |
| Protease inhibitor cocktail III | Research Products International | P50700-1 | |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, or Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Refrigerated benchtop centrifuge | Eppendorf | model no. 5424 R | |
| Rotator (Labquake Shaker Rotisserie) | Thermo Scientific | 13-687-12Q | 8 rpm rotation |
| Sample collection plate, 96- well, 1 mL | Waters | WAT058957 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP1311-1 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V511C | |
| Sodium azide | EMD Chemicals | SX0299-1 | CAUTION: Sodium azide is explosive and toxic; wear gloves, work in a chemical fume hood and avoid contact with metals. |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S27110 | |
| Sonicator (Branson digital sonifier) | model no. SFX 250 | ||
| SPE C18 desalting plate | Waters | 186001828BA | |
| SpeedBeads magnetic carboxylate modified particles (SP3 beads) | Cytiva | 6.51521E+13 | |
| Thermomixer | Eppendorf | model no. 5350 | |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 × 0.8 mg per tag | ThermoFisher | A37725 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Honeywell | T6508-25ML | CAUTION: TFA is corrosive and will irritate skin on contact. Wear gloves and eye protection, and work in a chemical fume hood. |
| Tris Base | Research Products International | T60040 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Vacuum centrifuge and vapor trap | Thermo Scientific | model nos. SpeedVac SPD120 and RVT5105 | |
| Vortexer (Vortex-Genie 2) | Scientific Industries | ||
| Water LC-MS | Honeywell | LC365-4 |
References
- Nilsson, J. Protein phosphatases in the regulation of mitosis. Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).
- Brautigan, D. L. Protein Ser/Thr phosphatases–the ugly ducklings of cell signalling. The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).
- Brautigan, D. L., Shenolikar, S. Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates. Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).
- Janssens, V., Goris, J. Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling. Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).
- Virshup, D. M., Shenolikar, S. From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover. Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).
- Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. The extended PP1 toolkit: designed to create specificity. Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).
- Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. 4D-networking by mitotic phosphatases. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).
- Heroes, E., et al. The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity. The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).
- Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer. Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).
- Bantscheff, M., et al. Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors. Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).
- Klaeger, S., et al. Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors. ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).
- Duncan, J. S., et al. Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer. Cell. 149 (2), 307-321 (2012).
- Cooper, M. J., et al. Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia. PLoS ONE. 8 (6), 66755 (2013).
- Lyons, S. P., et al. A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans. Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).
- Nasa, I., et al. Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry. Science Signaling. 13 (648), (2020).
- Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse. Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).
- Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose. Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).
- Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).
- Hughes, C. S., Moggridge, S., Müller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Zecha, J., et al. TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach. Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool. Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins. Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).
