Preparación y análisis morfológico de cultivos de células de cresta neural craneal de pollo
Summary
Este protocolo versátil describe el aislamiento de células de la cresta neural premigratoria (NCC) a través de la escisión de pliegues neurales craneales de embriones de pollo. Tras el recubrimiento y la incubación, las NCC migratorias emergen de los explantes del pliegue neural, lo que permite la evaluación de la morfología celular y la migración en un entorno 2D simplificado.
Abstract
Durante el desarrollo de los vertebrados, las células de la cresta neural (NCC) migran ampliamente y se diferencian en varios tipos de células que contribuyen a estructuras como el esqueleto craneofacial y el sistema nervioso periférico. Si bien es fundamental comprender la migración de NCC en el contexto de un embrión 3D, el aislamiento de células migratorias en cultivo 2D facilita la visualización y la caracterización funcional, complementando los estudios embrionarios. El presente protocolo demuestra un método para aislar los pliegues neurales craneales de los pollitos para generar cultivos primarios de NCC. Los NCC migratorios emergen de los explantes del pliegue neural colocados en un sustrato recubierto de fibronectina. Esto da como resultado poblaciones de NCC dispersas y adherentes que pueden evaluarse mediante tinción y análisis morfológicos cuantitativos. Este enfoque de cultivo simplificado es altamente adaptable y se puede combinar con otras técnicas. Por ejemplo, la emigración de NCC y los comportamientos migratorios pueden evaluarse mediante imágenes de lapso de tiempo o consultarse funcionalmente mediante la inclusión de inhibidores o manipulaciones experimentales de la expresión génica (por ejemplo, ADN, morfolino o electroporación CRISPR). Debido a su versatilidad, este método proporciona un poderoso sistema para investigar el desarrollo craneal de NCC.
Introduction
Las células de la cresta neural (NCC) son una población celular transitoria en embriones de vertebrados. Las NCC se especifican en los bordes de la placa neural y experimentan una transición epitelial-mesenquimal (EMT) para migrar desde el tubo neural dorsal1. Después de la EMT, las NCC se dispersan extensamente por todo el embrión, diferenciando y contribuyendo finalmente a varias estructuras, incluido el esqueleto craneofacial, el tracto de salida del corazón y la mayoría del sistema nervioso periférico2. Los cambios en la polaridad celular, el citoesqueleto y las propiedades de adhesión subyacen a este cambio de una población celular premigratoria a una migratoria3. El estudio de NCC EMT y la migración proporciona información sobre los mecanismos fundamentales de la motilidad celular e informa los esfuerzos para prevenir y tratar defectos de nacimiento y metástasis del cáncer.
Si bien el análisis in vivo es vital para comprender los procesos de desarrollo de NCC en un contexto embrionario, los métodos in vitro ofrecen accesibilidad visual y física que facilitan vías experimentales adicionales. En un entorno 2D simplificado, se puede evaluar la morfología de NCC, las estructuras citoesqueléticas y la distancia migrada. Además, se pueden analizar los efectos de la perturbación genética o del factor soluble sobre los comportamientos migratorios de las NCC móviles 4,5,6,7,8,9,10. Además, las NCC premigratorias o migratorias aisladas pueden ser recolectadas, agrupadas y utilizadas para metodologías de alto rendimiento para estudiar la regulación del desarrollo de las NCC a través de perfiles proteómicos, transcriptómicos y epigenómicos 7,11. Si bien hay métodos disponibles para preparar NCC craneales a partir de varios organismos modelo de desarrollo12,13,14, este artículo demuestra la mecánica del enfoque para aquellos que primero aprenden a cultivar NCC craneal a partir de embriones de pollo.
El protocolo actual describe una técnica versátil para preparar cultivos craneales de NCC de pollo (Figura 1). Debido a que los NCC migran fácilmente de los pliegues neurales explantados a un sustrato de cultivo, los NCC de los pollitos se segregan naturalmente del tejido embrionario, y los cultivos primarios se generan fácilmente. A medida que las NCC del mesencéfalo migran en masa desde los pliegues neurales craneales (en contraste con la delaminación prolongada célula por célula en el tronco15), estos cultivos consisten principalmente en células migratorias de la cresta neural craneal, con la escisión inicial del pliegue neural que proporciona un método de recolección para las NCC premigratorias. Se detalla un método básico para diseccionar y cultivar pliegues neurales craneales de pollo, y se ofrecen sugerencias para diferentes aplicaciones y variaciones de este método.
Figura 1: Descripción esquemática del protocolo de cultivo del pliegue neural craneal de pollo. (A,B) Los pliegues neurales craneales (delineados en azul) se extirpan de un embrión de pollo con cinco somitas (se muestra en vista dorsal en A). Bandas grises, media luna cardíaca. (C) Cuando se colocan en fibronectina, las células migratorias de la cresta neural emergen de los pliegues neurales y se dispersan sobre el sustrato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
La técnica descrita aquí proporciona un método adaptable para aislar los pliegues neurales de los pollitos y colocarlos en placas para crear cultivos de NCC craneales migratorios. Estos cultivos proporcionan condiciones 2D simplificadas para un fácil análisis de la migración y morfología de NCC de los pollitos que pueden complementar los métodos de imagen in ovo más desafiantes técnicamente24,25,26. Si bien es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Corinne A. Fairchild y Katie L. Vermillion, quienes participaron en el desarrollo de nuestra versión del protocolo de cultivo del pliegue neural craneal del pollo.
Materials
| AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software | Zeiss | Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Chamber dishes (glass bottom, single or divided) | MatTek; Cell Vis | P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis) |
Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm |
| Cover glass | Carolina Biological Supply Company | 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 | circles, 0.13–0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | Alternative for L15 media |
| Egg incubator | Sportsman | 1502 | |
| FBS | Life Technologies | 10437-028 | |
| Fibronectin | Fisher Scientific | CB-40008A | |
| Filter paper | Whatman | grade 3MM chromatography | |
| Forceps (blunt) | Fisher Scientific; Thomas Scientific | 08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas) | |
| Forceps (fine) | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Image J | https://fiji.sc/ | Free image analysis software | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| L15 media | Invitrogen | 11415064 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold) | Vector Laboratories; Thermofisher Scientific | H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold) | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-148 | 10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin |
| Petri Dishes | VWR (or similar) | 60 mm, 100 mm | |
| Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | multiple flurophores available |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | For tungsten needle (alternative for spring scissors) |
| Scissors (dissection) | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | 2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle) |
| Sylgard | Krayden | Sylgard 184 | |
| Syringe Filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Tissue culture dishes | Sarstedt | 83-3900 | 35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tungsten wire | Variety of sources | 0.01" diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors) |
References
- Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells. Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).
- Tang, W., Bronner, M. E. Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory. Development. 147 (20), (2021).
- Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest. Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).
- McLennan, R., et al. Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia. Development. 147 (1), 185231 (2020).
- Carmona-Fontaine, C., et al. Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration. Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).
- Giovannone, D., et al. Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor. Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).
- Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration. Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).
- Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Gonzalez Malagon, S. G., et al. Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus. Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).
- Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling. Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).
- Jacques-Fricke, B. T., et al. Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors. Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).
- Bronner-Fraser, M., García-Castro, M. Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways. Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of Visualized Experiments. (85), e51118 (2014).
- Malagon, S. G. G., et al. Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration. Journal of Visualized Experiments. (152), e60051 (2019).
- Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).
- Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. Embryological and genetic manipulation of chick development. Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).
- Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. The phalloidin binding site of F-actin. The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).
- Bronner-Fraser, M. Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1. Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Soille, P., Vincent, L. Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations. Visual Communications and Image Processing ’90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).
- Haupt, A., Minc, N. How cells sense their own shape – mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
- Ezin, M., Fraser, S. Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).
- Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In ovo live imaging of avian embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).
- McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo. Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).
- Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration. Journal of Cell Science. , (2022).
- Williams, R., Sauka-Spengler, T. Ex ovo electroporation of early chicken embryos. STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).
- Moulton, J. D. Using morpholinos to control gene expression. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).
- Gandhi, S., et al. A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos. Development. 148 (7), (2021).
- Williams, R. M., et al. Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo. Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).
