إعداد وتحليل مورفولوجي لمزارع خلايا القمة العصبية القحفية للكتكوت
Summary
يصف هذا البروتوكول متعدد الاستخدامات عزل خلايا القمة العصبية المهاجرة (NCCs) من خلال استئصال الطيات العصبية القحفية من أجنة الكتاكيت. عند الطلاء والحضانة ، تظهر NCCs المهاجرة من الطيات العصبية ، مما يسمح بتقييم مورفولوجيا الخلية والهجرة في بيئة 2D مبسطة.
Abstract
أثناء تطور الفقاريات ، تهاجر خلايا القمة العصبية (NCCs) على نطاق واسع وتتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا التي تساهم في هياكل مثل الهيكل العظمي القحفي الوجهي والجهاز العصبي المحيطي. في حين أنه من الأهمية بمكان فهم هجرة NCC في سياق الجنين 3D ، فإن عزل الخلايا المهاجرة في ثقافة 2D يسهل التصور والتوصيف الوظيفي ، مكملا الدراسات الجنينية. يوضح البروتوكول الحالي طريقة لعزل الطيات العصبية القحفية للكتاكيت لتوليد مزارع NCC الأولية. تنبثق NCCs المهاجرة من الطيات العصبية المطلية على ركيزة مغلفة بالفيبرونيكتين. وينتج عن ذلك مجموعات سكانية مشتتة ومترابطة تابعة ل NCC يمكن تقييمها عن طريق التحليق والتحليلات المورفولوجية الكمية. هذا النهج الثقافي المبسط قابل للتكيف بشكل كبير ويمكن دمجه مع تقنيات أخرى. على سبيل المثال، يمكن تقييم سلوكيات الهجرة والهجرة NCC عن طريق التصوير بالفاصل الزمني أو الاستعلام عنها وظيفيا من خلال تضمين مثبطات أو تلاعبات تجريبية بالتعبير الجيني (على سبيل المثال، الحمض النووي، أو مورفولينو، أو كريسبر إلكتروبوراتيون). بسبب تنوعها ، توفر هذه الطريقة نظاما قويا للتحقيق في تطوير NCC في الجمجمة.
Introduction
خلايا القمة العصبية (NCCs) هي مجموعة خلايا عابرة في أجنة الفقاريات. يتم تحديد NCCs عند حدود الصفيحة العصبية وتخضع لانتقال ظهاري إلى وسيط (EMT) للهجرة من الأنبوب العصبي الظهري1. بعد EMT ، تنتشر NCCs على نطاق واسع في جميع أنحاء الجنين ، مما يؤدي في النهاية إلى التمييز والمساهمة في هياكل مختلفة ، بما في ذلك الهيكل العظمي القحفي الوجهي ، ومسار التدفق الخارجي للقلب ، وغالبية الجهاز العصبي المحيطي2. التغيرات في قطبية الخلية ، والهيكل الخلوي ، وخصائص الالتصاق وراء هذا التحول من مجموعة الخلايا المهاجرة إلى الخلايا المهاجرة3. توفر دراسة NCC EMT والهجرة نظرة ثاقبة على الآليات الأساسية لحركية الخلايا وإبلاغ الجهود المبذولة لمنع وعلاج العيوب الخلقية وورم خبيث السرطان.
في حين أن التحليل في الجسم الحي أمر حيوي لفهم العمليات التنموية NCC في سياق جنيني ، فإن الأساليب في المختبر توفر إمكانية الوصول البصري والمادي التي تسهل طرقا تجريبية إضافية. في بيئة 2D مبسطة ، يمكن تقييم مورفولوجيا NCC والهياكل الهيكلية الخلوية والمسافة التي تم ترحيلها. علاوة على ذلك ، يمكن تحليل آثار اضطراب العوامل الوراثية أو القابلة للذوبان على سلوكيات الهجرة ل NCCs المتحركة 4,5,6,7,8,9,10. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن جمع NCCs المعزولة قبل الهجرة أو الهجرة وتجميعها واستخدامها في منهجيات عالية الإنتاجية لدراسة التنظيم التنموي ل NCCs من خلال التنميط البروتيني والنسخي واللاجينومي 7,11. في حين أن الطرق متاحة لإعداد NCCs الجمجمة من مختلف الكائنات الحية النموذجية التنموية12،13،14 ، توضح هذه المقالة آليات النهج لأولئك الذين يتعلمون أولا لزراعة NCC الجمجمة من أجنة الكتاكيت.
يصف البروتوكول الحالي تقنية متعددة الاستخدامات لإعداد مزارع NCC في الجمجمة الفركتية (الشكل 1). نظرا لأن NCCs تهاجر بسهولة من الطيات العصبية المزروعة إلى ركيزة مستزرعة ، فإن NCCs الكتاكيت تنفصل بشكل طبيعي عن الأنسجة الجنينية ، ويتم توليد الثقافات الأولية بسهولة. مع هجرة NCCs في الدماغ المتوسط بشكل جماعي من الطيات العصبية القحفية (على النقيض من التفكيك المطول لكل خلية على حدة في الجذع15) ، تتكون هذه الثقافات بشكل رئيسي من خلايا القمة العصبية القحفية المهاجرة ، مع استئصال الطية العصبية الأولية التي توفر طريقة جمع ل NCCs المهاجرة. يتم تفصيل طريقة أساسية لتشريح وزراعة الطيات العصبية القحفية للكتاكيت ، ويتم تقديم اقتراحات لتطبيقات واختلافات مختلفة على هذه الطريقة.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على بروتوكول زراعة الطيات العصبية في الجمجمة (A,B) يتم استئصال الطيات العصبية القحفية (الموضحة باللون الأزرق) من جنين الفرخ مع خمسة سوميت (كما هو موضح في المنظر الظهري في A). العصابات الرمادية ، الهلال القلبي. (ج) عندما تكون مطلية على الفيبرونيكتين ، تخرج خلايا القمة العصبية المهاجرة من الطيات العصبية وتنتشر على الركيزة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر التقنية الموصوفة هنا طريقة قابلة للتكيف لعزل الطيات العصبية للكتاكيت وطلائها لإنشاء ثقافات من NCCs الجمجمية المهاجرة. توفر هذه الثقافات ظروفا مبسطة ثنائية الأبعاد لسهولة تحليل هجرة NCC ومورفولوجيا الفرخ التي يمكن أن تكمل أكثر تحديا تقنيا في طرق تصوير البويضة 24،<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر كورين أ. فيرتشايلد وكاتي ل. فيرمليون ، اللتين شاركتا في تطوير نسختنا من بروتوكول زراعة الطيات العصبية في الجمجمة الفرخية.
Materials
| AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software | Zeiss | Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Chamber dishes (glass bottom, single or divided) | MatTek; Cell Vis | P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis) |
Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm |
| Cover glass | Carolina Biological Supply Company | 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 | circles, 0.13–0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | Alternative for L15 media |
| Egg incubator | Sportsman | 1502 | |
| FBS | Life Technologies | 10437-028 | |
| Fibronectin | Fisher Scientific | CB-40008A | |
| Filter paper | Whatman | grade 3MM chromatography | |
| Forceps (blunt) | Fisher Scientific; Thomas Scientific | 08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas) | |
| Forceps (fine) | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Image J | https://fiji.sc/ | Free image analysis software | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| L15 media | Invitrogen | 11415064 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold) | Vector Laboratories; Thermofisher Scientific | H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold) | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-148 | 10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin |
| Petri Dishes | VWR (or similar) | 60 mm, 100 mm | |
| Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | multiple flurophores available |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | For tungsten needle (alternative for spring scissors) |
| Scissors (dissection) | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | 2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle) |
| Sylgard | Krayden | Sylgard 184 | |
| Syringe Filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Tissue culture dishes | Sarstedt | 83-3900 | 35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tungsten wire | Variety of sources | 0.01" diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors) |
References
- Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells. Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).
- Tang, W., Bronner, M. E. Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory. Development. 147 (20), (2021).
- Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest. Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).
- McLennan, R., et al. Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia. Development. 147 (1), 185231 (2020).
- Carmona-Fontaine, C., et al. Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration. Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).
- Giovannone, D., et al. Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor. Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).
- Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration. Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).
- Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Gonzalez Malagon, S. G., et al. Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus. Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).
- Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling. Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).
- Jacques-Fricke, B. T., et al. Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors. Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).
- Bronner-Fraser, M., García-Castro, M. Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways. Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of Visualized Experiments. (85), e51118 (2014).
- Malagon, S. G. G., et al. Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration. Journal of Visualized Experiments. (152), e60051 (2019).
- Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).
- Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. Embryological and genetic manipulation of chick development. Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).
- Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. The phalloidin binding site of F-actin. The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).
- Bronner-Fraser, M. Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1. Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Soille, P., Vincent, L. Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations. Visual Communications and Image Processing ’90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).
- Haupt, A., Minc, N. How cells sense their own shape – mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
- Ezin, M., Fraser, S. Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).
- Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In ovo live imaging of avian embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).
- McKinney, M. C., Kulesa, P. M. Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo. Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).
- Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration. Journal of Cell Science. , (2022).
- Williams, R., Sauka-Spengler, T. Ex ovo electroporation of early chicken embryos. STAR Protocols. 2 (2), 100424 (2021).
- Moulton, J. D. Using morpholinos to control gene expression. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).
- Gandhi, S., et al. A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos. Development. 148 (7), (2021).
- Williams, R. M., et al. Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo. Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).
