Preparazione e analisi morfologica di colture cellulari di cresta neurale cranica di pulcino
Summary
Questo protocollo versatile descrive l’isolamento delle cellule della cresta neurale premigratoria (NCC) attraverso l’escissione di pieghe neurali craniche da embrioni di pulcino. Dopo la placcatura e l’incubazione, gli NCC migratori emergono dagli espianti di piega neurale, consentendo la valutazione della morfologia cellulare e della migrazione in un ambiente 2D semplificato.
Abstract
Durante lo sviluppo dei vertebrati, le cellule della cresta neurale (NCC) migrano ampiamente e si differenziano in vari tipi di cellule che contribuiscono a strutture come lo scheletro craniofacciale e il sistema nervoso periferico. Mentre è fondamentale comprendere la migrazione NCC nel contesto di un embrione 3D, l’isolamento delle cellule migratorie in coltura 2D facilita la visualizzazione e la caratterizzazione funzionale, integrando gli studi embrionali. Il presente protocollo dimostra un metodo per isolare le pieghe neurali craniche dei pulcini per generare colture NCC primarie. Gli NCC migratori emergono da espianti di piega neurale placcati su un substrato rivestito di fibronectina. Ciò si traduce in popolazioni NCC disperse e aderenti che possono essere valutate mediante colorazione e analisi morfologiche quantitative. Questo approccio culturale semplificato è altamente adattabile e può essere combinato con altre tecniche. Ad esempio, l’emigrazione NCC e i comportamenti migratori possono essere valutati mediante imaging time-lapse o interrogati funzionalmente includendo inibitori o manipolazioni sperimentali dell’espressione genica (ad esempio, DNA, morfolino o elettroporazione CRISPR). Grazie alla sua versatilità, questo metodo fornisce un potente sistema per studiare lo sviluppo di NCC cranici.
Introduction
Le cellule della cresta neurale (NCC) sono una popolazione di cellule transitorie negli embrioni vertebrati. Le NCC sono specificate ai bordi della piastra neurale e subiscono una transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) per migrare dal tubo neurale dorsale1. Dopo l’EMT, le NCC si disperdono ampiamente in tutto l’embrione, differenziandosi e contribuendo a varie strutture, tra cui lo scheletro craniofacciale, il tratto di deflusso del cuore e la maggior parte del sistema nervoso periferico2. I cambiamenti nella polarità cellulare, nel citoscheletro e nelle proprietà di adesione sono alla base di questo passaggio da una popolazione cellulare preliminaria a una popolazione di cellule migratorie3. Lo studio dell’EMT e della migrazione NCC fornisce approfondimenti sui meccanismi fondamentali della motilità cellulare e informa gli sforzi per prevenire e curare i difetti alla nascita e le metastasi del cancro.
Mentre l’analisi in vivo è vitale per comprendere i processi di sviluppo NCC in un contesto embrionale, i metodi in vitro offrono accessibilità visiva e fisica che facilitano ulteriori vie sperimentali. In un ambiente 2D semplificato, è possibile valutare la morfologia NCC, le strutture citoscheletriche e la distanza migrata. Inoltre, gli effetti della perturbazione genetica o solubile dei fattori sui comportamenti migratori delle NCC mobili possono essere analizzati 4,5,6,7,8,9,10. Inoltre, NCC premigratory o migratorie isolate possono essere raccolte, raggruppate e utilizzate per metodologie ad alto rendimento per studiare la regolazione dello sviluppo delle NCC attraverso profili proteomici, trascrittomici ed epigenomici 7,11. Mentre sono disponibili metodi per la preparazione di NCC cranici da vari organismi modello di sviluppo12,13,14, questo articolo dimostra la meccanica dell’approccio per coloro che imparano per la prima volta a coltivare NCC cranici da embrioni di pulcino.
L’attuale protocollo descrive una tecnica versatile per la preparazione di colture di NCC craniche di pulcino (Figura 1). Poiché gli NCC migrano facilmente dalle pieghe neurali espiantate su un substrato di coltura, gli NCC di pulcino si separano naturalmente dal tessuto embrionale e le colture primarie sono facilmente generate. Poiché le NCC del mesencefalo migrano in massa dalle pieghe neurali craniche (in contrasto con la delaminazione prolungata, cellula per cellula nel tronco15), queste colture consistono principalmente di cellule migratorie della cresta neurale cranica, con l’escissione iniziale della piega neurale che fornisce un metodo di raccolta per le NCC premigatorie. Viene dettagliato un metodo di base per sezionare e coltivare le pieghe neurali craniche dei pulcini e vengono offerti suggerimenti per diverse applicazioni e variazioni di questo metodo.
Figura 1: Panoramica schematica del protocollo di coltura neurale cranica del pulcino. (A,B) Le pieghe neurali craniche (delineate in blu) sono asportate da un embrione di pulcino con cinque somiti (mostrati in vista dorsale in A). Bande grigie, mezzaluna cardiaca. (C) Quando placcate sulla fibronectina, le cellule della cresta neurale migratoria emergono dalle pieghe neurali e si disperdono sul substrato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica qui descritta fornisce un metodo adattabile per isolare le pieghe neurali dei pulcini e placcarle per creare colture di NCC cranici migratori. Queste colture forniscono condizioni 2D semplificate per una facile analisi della migrazione e della morfologia NCC del pulcino che possono integrare metodi di imaging più tecnicamente impegnativi in ovo 24,25,26. Mentre questo metodo in vitro è relativament…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Corinne A. Fairchild e Katie L. Vermillion, che hanno partecipato allo sviluppo della nostra versione del protocollo di coltura della piega neurale cranica del pulcino.
Materials
| AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software | Zeiss | Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Chamber dishes (glass bottom, single or divided) | MatTek; Cell Vis | P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis) |
Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm |
| Cover glass | Carolina Biological Supply Company | 633029, 633031, 633033, 633035, 633037 | circles, 0.13–0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | Alternative for L15 media |
| Egg incubator | Sportsman | 1502 | |
| FBS | Life Technologies | 10437-028 | |
| Fibronectin | Fisher Scientific | CB-40008A | |
| Filter paper | Whatman | grade 3MM chromatography | |
| Forceps (blunt) | Fisher Scientific; Thomas Scientific | 08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas) | |
| Forceps (fine) | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| Image J | https://fiji.sc/ | Free image analysis software | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| L15 media | Invitrogen | 11415064 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold) | Vector Laboratories; Thermofisher Scientific | H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold) | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-148 | 10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin |
| Petri Dishes | VWR (or similar) | 60 mm, 100 mm | |
| Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | multiple flurophores available |
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | For tungsten needle (alternative for spring scissors) |
| Scissors (dissection) | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | 2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle) |
| Sylgard | Krayden | Sylgard 184 | |
| Syringe Filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized |
| Tissue culture dishes | Sarstedt | 83-3900 | 35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tungsten wire | Variety of sources | 0.01" diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors) |
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