Ein kompetentes Hepatozytenmodell, das den Eintritt von Hepatitis-B-Viren durch Natriumtaurocholat cotransportierendes Polypeptid als therapeutisches Ziel untersucht

Die Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) gilt weltweit als lebensbedrohliche Krankheit. Eine chronische HBV-Infektion birgt ein Risiko für Leberzirrhose und hepatozelluläres Karzinom¹. Die derzeitige Anti-HBV-Behandlung konzentriert sich hauptsächlich auf den postviralen Eintritt unter Verwendung von Nukleos(t)ide-Analoga (NAs) und Interferon-alpha (IFN-α)^2,3. Die Entdeckung eines HBV-Eintrittsinhibitors, Myrcludex B, hat ein neues Ziel für Anti-HBV-Wirkstoffe identifiziert⁴. Die Kombination von Eintrittsinhibitoren und NAs bei chronischem HBV hat die Viruslast im Vergleich zu denen, die nur auf die Virusreplikation abzielen, signifikant verringert ^5,6. Das klassische Hepatozytenmodell für das Screening von HBV-Eintrittsinhibitoren ist jedoch durch niedrige virale Rezeptorspiegel (Natriumtaurocholat-Cotransporting-Polypeptid, NTCP) begrenzt. Die Überexpression von hNTCP in Hepatomzellen (d.h. HepG2 und Huh7) verbessert die HBV-Infektiosität ^7,8. Dennoch exprimieren diese Zelllinien geringe Mengen an medikamentenmetabolisierenden Enzymen der Phasen I und II und weisen eine genetische Instabilität auf⁹. Hepatozytenmodelle, die helfen können, verschiedene Mechanismen von Anti-HBV-Kandidatenverbindungen wie präviralen Eintrag, NTCP-Bindung und viralen Eintritt anzusprechen, würden die Identifizierung und Entwicklung wirksamer Kombinationsschemata beschleunigen. Die Studie zur Anti-HBV-Aktivität von Curcumin hat die Hemmung des Viruseintritts als neuen Mechanismus zusätzlich zur postviralen Eintrittsunterbrechung aufgeklärt. Dieses Protokoll beschreibt ein Wirtsmodell für das Screening von Anti-HBV-Eintrittsmolekülen¹⁰.

Das Ziel dieser Methode ist es, mögliche Anti-HBV-Verbindungen für die Hemmung des Viruseintritts zu erforschen, insbesondere die Blockierung der NTCP-Bindung und des NTCP-Transports. Da die NTCP-Expression ein kritischer Faktor für den HBV-Eintritt und die Infektion ist, haben wir das Hepatozyten-Reifungsprotokoll optimiert, um die NTCP-Werte^{zu maximieren 11}. Darüber hinaus kann dieses Protokoll die hemmende Wirkung auf den HBV-Eintritt als Hemmung der HBV-Bindung gegenüber Hemmung der Internalisierung unterscheiden. Der Aufnahmetest für Taurocholsäure (TCA) wurde ebenfalls unter Verwendung einer ELISA-basierten Methode anstelle eines Radioisotops modifiziert, um den NTCP-Transport^12,13 darzustellen. Die Rezeptor- und Ligandeninteraktion wurde durch ihre 3D-Strukturen^{bestätigt 14,15}. Die Hemmung der NTCP-Funktion kann durch Messung der TCA-Aufnahmeaktivität¹⁶ bewertet werden. Diese Technik lieferte jedoch keinen direkten Nachweis einer NTCP-Bindung an die Kandidaten-Inhibitoren. Daher kann die Bindung mit verschiedenen Techniken untersucht werden, wie z.B. Oberflächenplasmonresonanz 17, ELISA, fluoreszenzbasierter Thermoverschiebungsassay (FTSA)¹⁸, FRET¹⁹, AlphaScreen und verschiedenen anderen Methoden²⁰. Unter diesen Techniken ist ITC ein Zielstandard in der Bindungsanalyse, da es Wärmeabsorption oder -emission in fast jeder Reaktion beobachten kann²¹. Die Bindungsaffinität (K_D) von NTCP und Kandidatenverbindungen wurde direkt mittels ITC bewertet; Diese Affinitätswerte waren genauer als diejenigen, die mit dem In-silico-Vorhersagemodell ²² ermittelt wurden.

Dieses Protokoll behandelt Techniken zur Hepatozytenreifung, HBV-Infektion und zum Screening auf HBV-Eintrittshemmer. Kurz gesagt, ein Hepatozytenmodell wurde basierend auf imHC- und HepaRG-Zelllinien entwickelt. Die kultivierten Zellen wurden innerhalb von 2 Wochen zu reifen Hepatozyten differenziert. Die Hochregulierung der NTCP-Spiegel wurde mittels real-time PCR, Western Blot und Durchflusszytometrie^{nachgewiesen 11}. Hepatitis-B-Virion (HBVcc) wurde produziert und aus HepG2.2.15 gesammelt. Das differenzierte imHC bzw. HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) wurde 2 h vor der Inokulation mit HBV-Virion prophylaktisch mit den Anti-HBV-Kandidaten behandelt. Das erwartete Ergebnis des Experiments war die Identifizierung der Wirkstoffe, die zelluläres HBV und Infektiosität verringern. Die Anti-NTCP-Aktivität wurde mit dem TCA-Aufnahmetest bewertet. Die NTCP-Aktivität konnte von den Agenten unterdrückt werden, die NTCP spezifisch gebunden haben. Die ITC-Technik wurde verwendet, um die Machbarkeit einer interaktiven Bindung zu untersuchen, die Inhibitoren und ihre Zielproteine vorhersagen kann, indem die Bindungsaffinität (K_D) des Liganden für den Rezeptor über nicht-kovalente Wechselwirkungen des biomolekularen Komplexes^{bestimmt wird 23,24}. Zum Beispiel steht K D ≥ 1 × 10³ mM für schwache Bindung, K D ≥ 1 × 10⁶ μM für moderate Bindung und K _D ≤ 1 × 10⁹ nM für starke Bindung. Das ΔG korreliert direkt mit Bindungswechselwirkungen. Insbesondere ist eine Reaktion mit negativem ΔG eine exergonische Reaktion, was darauf hinweist, dass die Bindung ein spontaner Prozess ist. Eine Reaktion mit einem negativen ΔH deutet darauf hin, dass die Bindungsprozesse von Wasserstoffbrückenbindungen und Van-der-Waals-Kräften abhängen. Sowohl TCA-Aufnahme als auch ITC-Daten könnten verwendet werden, um nach Anti-HBV-Eintragsagenten zu suchen. Die Ergebnisse dieser Protokolle können eine Grundlage nicht nur für das Anti-HBV-Screening bilden, sondern auch für die Interaktion mit NTCP, die durch Bindungsaffinität und Transportfunktion bewertet wird. Dieser Artikel beschreibt die Vorbereitung und Charakterisierung von Wirtszellen, das experimentelle Design und die Bewertung des Anti-HBV-Eintritts zusammen mit der NTCP-Bindungsaffinität.