Un modèle hépatocytaire compétent examinant l’entrée du virus de l’hépatite B par le polypeptide cotransportant le taurocholate de sodium comme cible thérapeutique

L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) est considérée comme une maladie potentiellement mortelle dans le monde entier. L’infection chronique par le VHB est chargée d’un risque de cirrhose du foie et de carcinome hépatocellulaire¹. Le traitement anti-VHB actuel se concentre principalement sur l’entrée post-virale à l’aide d’analogues nucléos(t)ide (NA) et d’interféron alpha (IFN-α)^2,3. La découverte d’un inhibiteur de l’entrée du VHB, Myrcludex B, a permis d’identifier une nouvelle cible pour les agents anti-VHB⁴. La combinaison d’inhibiteurs d’entrée et d’AN dans le VHB chronique a considérablement réduit la charge virale par rapport à ceux ciblant uniquement la réplication virale ^5,6. Cependant, le modèle classique d’hépatocytes pour le dépistage des inhibiteurs de l’entrée du VHB est limité par de faibles niveaux de récepteurs viraux (polypeptide cotransportant du taurocholate de sodium, NTCP). La surexpression du PCNh dans les cellules d’hépatome (c.-à-d. HepG2 et Huh7) améliore l’infectiosité^du VHB ^7,8. Néanmoins, ces lignées cellulaires expriment de faibles niveaux d’enzymes métabolisant les médicaments de phase I et II et présentent une instabilité génétique⁹. Les modèles hépatocytes qui peuvent aider à cibler des mécanismes distincts des composés anti-VHB candidats tels que l’entrée prévirale, la liaison au PNCP et l’entrée virale accéléreraient l’identification et le développement de schémas thérapeutiques combinés efficaces. L’étude sur l’activité anti-VHB de la curcumine a élucidé l’inhibition de l’entrée virale en tant que nouveau mécanisme en plus de l’interruption post-entrée virale. Ce protocole détaille un modèle hôte pour le criblage des molécules d’entrée anti-VHB¹⁰.

L’objectif de cette méthode est d’explorer des composés anti-VHB candidats pour l’inhibition de l’entrée virale, en particulier le blocage de la liaison et du transport du NTCP. Comme l’expression du PNCP est un facteur critique pour l’entrée et l’infection du VHB, nous avons optimisé le protocole de maturation des hépatocytes pour maximiser les niveaux de NTCP¹¹. En outre, ce protocole peut différencier l’effet inhibiteur sur l’entrée du VHB comme inhibition de l’attachement du VHB par rapport à l’inhibition de l’internalisation. Le test d’absorption de l’acide taurocholique (TCA) a également été modifié à l’aide d’une méthode basée sur ELISA au lieu d’un radio-isotope pour représenter le transport du PNCC^12,13. L’interaction récepteur et ligand a été confirmée par leurs structures 3D^14,15. L’inhibition de la fonction du PNCC peut être évaluée en mesurant l’activité d’absorption du TCA¹⁶. Cependant, cette technique n’a pas fourni de preuve directe de la liaison du PNCC aux inhibiteurs candidats. Par conséquent, la liaison peut être étudiée à l’aide de diverses techniques, telles que la résonance plasmonique^{de surface 17}, ELISA, le test de décalage thermique basé sur la fluorescence (FTSA)18, FRET ¹⁹, AlphaScreen et diverses autres méthodes²⁰. Parmi ces techniques, l’ITC est un standard d’objectif dans l’analyse de liaison car il permet d’observer l’absorption ou l’émission de chaleur dans presque toutes les réactions²¹. L’affinité de liaison (K_D) du PNCC et des composés candidats a été directement évaluée à l’aide de l’ITC; Ces valeurs d’affinité étaient plus précises que celles obtenues à l’aide du modèle de prédiction in silico ²².

Ce protocole couvre les techniques de maturation des hépatocytes, d’infection par le VHB et de dépistage des inhibiteurs d’entrée du VHB. En bref, un modèle d’hépatocytes a été développé à partir de lignées cellulaires imHC et HepaRG. Les cellules en culture ont été différenciées en hépatocytes matures en 2 semaines. La régulation positive des niveaux de NTCP a été détectée à l’aide de la PCR en temps réel, du transfert Western et de la cytométrie^{en flux 11}. Le virion de l’hépatite B (VHB) a été produit et recueilli à partir de l’hépatite HepG2.2.15. L’icHC différencié ou HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) a été traité de manière prophylactique avec les candidats anti-VHB 2 h avant l’inoculation avec le virion du VHB. Le résultat attendu de l’expérience était l’identification des agents qui diminuent le VHB cellulaire et l’infectiosité. L’activité anti-PNCC a été évaluée à l’aide du test d’absorption du TCA. L’activité du PNCP pouvait être supprimée par les agents qui liaient spécifiquement le PNCP. La technique ITC a été utilisée pour étudier la faisabilité d’une liaison interactive qui pourrait prédire les inhibiteurs et leurs protéines cibles, en déterminant l’affinité de liaison (K_D) du ligand pour le récepteur via des interactions non covalentes du complexe biomoléculaire^23,24. Par exemple, K D ≥ 1 × 10³ mM représente une liaison faible, K D ≥ 1 × 10⁶ μM représente une liaison modérée et K _D ≤ 1 × 10⁹ nM représente une liaison forte. Le ΔG est directement corrélé avec les interactions de liaison. En particulier, une réaction avec ΔG négatif est une réaction exergonique, indiquant que la liaison est un processus spontané. Une réaction avec un ΔH négatif indique que les processus de liaison dépendent de la liaison hydrogène et des forces de Van der Waals. L’absorption du TCA et les données de l’ITC pourraient être utilisées pour dépister les agents anti-VHB. Les résultats de ces protocoles peuvent fournir une base non seulement pour le dépistage anti-VHB, mais aussi pour l’interaction avec le PNCP telle qu’évaluée par affinité de liaison et fonction de transport. Cet article décrit la préparation et la caractérisation des cellules hôtes, la conception expérimentale et l’évaluation de l’entrée anti-VHB ainsi que l’affinité de liaison NTCP.