JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

نموذج كفء لخلايا الكبد يفحص دخول فيروس التهاب الكبد B من خلال الصوديوم Taurocholate cotransporting polypeptide كهدف علاجي

Published: May 10, 2022
doi:
10.3791/63761
, , , ,
1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy,Mahidol University, 2Program in Translational Medicine, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital,Mahidol University, 3Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science,Mahidol University, 4Department of Biotechnology, Faculty of Science,Mahidol University, 5Department of Pharmacology, Faculty of Medicine Siriraj Hospital,Mahidol University

Summary

نقدم بروتوكولا لفحص المركبات المضادة لفيروس التهاب الكبد B (HBV) التي تستهدف مراحل دورة حياة الدخول قبل وبعد الفيروس، باستخدام كالوريمتر المعايرة متساوي الحرارة لقياس تقارب الارتباط (KD) مع ببتيد ببتيد النقل المشترك لتوروكولات الصوديوم المضيف. تم تحديد الفعالية المضادة للفيروسات من خلال قمع علامات دورة الحياة الفيروسية (تكوين cccDNA ، والنسخ ، والتجميع الفيروسي).

Abstract

تعتبر عدوى فيروس التهاب الكبد B (HBV) عامل خطر حاسم لسرطان الخلايا الكبدية. العلاج الحالي يمكن أن يقلل فقط من الحمل الفيروسي ولكن لا يؤدي إلى مغفرة كاملة. من شأن نموذج خلايا الكبد الفعال لعدوى فيروس التهاب الكبد B أن يوفر دورة حياة فيروسية واقعية ستكون حاسمة لفحص العوامل العلاجية. تستهدف معظم العوامل المتاحة المضادة لفيروس التهاب الكبد B مراحل دورة الحياة بعد الدخول الفيروسي ولكن ليس قبل الدخول الفيروسي. يفصل هذا البروتوكول إنشاء نموذج كبدي كفء قادر على فحص العوامل العلاجية التي تستهدف مراحل دورة حياة الدخول قبل الفيروس وما بعد الفيروس. يتضمن ذلك استهداف ربط بولي ببتيد النقل المشترك لتوروكولات الصوديوم (NTCP) ، وتشكيل cccDNA ، والنسخ ، والتجميع الفيروسي بناء على imHC أو HepaRG كخلايا مضيفة. هنا ، استخدم اختبار تثبيط دخول HBV الكركمين لمنع وظائف ربط ونقل HBV عبر NTCP. تم تقييم مثبطات تقارب الارتباط (KD) مع NTCP باستخدام كالوريمتر المعايرة متساوي الحرارة (ITC) – وهي أداة عالمية لفحص أدوية HBV بناء على المعلمات الديناميكية الحرارية.

Introduction

تعتبر عدوى فيروس التهاب الكبد B (HBV) مرضا يهدد الحياة في جميع أنحاء العالم. عدوى فيروس التهاب الكبد B المزمنة محملة بخطر الإصابة بتليف الكبد وسرطان الخلايا الكبدية1. يركز العلاج الحالي المضاد لفيروس التهاب الكبد B في الغالب على الدخول بعد الفيروس باستخدام نظائر nucleos (t) ide (NAs) و interferon-alpha (IFN-α) 2،3. حدد اكتشاف مثبط دخول HBV ، Myrcludex B ، هدفا جديدا للعوامل المضادة ل HBV4. أدى الجمع بين مثبطات الدخول و NAs في فيروس التهاب الكبد B المزمن إلى تقليل الحمل الفيروسي بشكل كبير مقارنة بتلك التي تستهدف تكاثر الفيروس وحده 5,6. ومع ذلك ، فإن نموذج خلايا الكبد الكلاسيكي لفحص مثبطات دخول HBV محدود بمستويات مستقبلات فيروسية منخفضة (توروكولات الصوديوم cotransporting polypeptide ، NTCP). الإفراط في التعبير عن hNTCP في خلايا الورم الكبدي (أي HepG2 و Huh7) يحسن عدوى HBV 7,8. ومع ذلك ، فإن خطوط الخلايا هذه تعبر عن مستويات منخفضة من المرحلة الأولى والثانية من إنزيمات استقلاب الأدوية وتظهر عدم الاستقرار الجيني9. نماذج خلايا الكبد التي يمكن أن تساعد في استهداف آليات متميزة للمركبات المرشحة المضادة لفيروس التهاب الكبد B مثل الدخول قبل الفيروسي ، وربط NTCP ، والدخول الفيروسي من شأنها أن تسرع في تحديد وتطوير أنظمة الجمع الفعالة. أوضحت دراسة النشاط المضاد لفيروس التهاب الكبد B للكركمين تثبيط الدخول الفيروسي كآلية جديدة بالإضافة إلى انقطاع الدخول بعد الفيروس. يفصل هذا البروتوكول نموذجا مضيفا لفحص جزيئات دخول HBVالمضادة 10.

الهدف من هذه الطريقة هو استكشاف المركبات المرشحة المضادة لفيروس التهاب الكبد B لتثبيط الدخول الفيروسي ، وخاصة منع ربط NTCP ونقله. نظرا لأن تعبير NTCP هو عامل حاسم لدخول HBV والعدوى ، فقد قمنا بتحسين بروتوكول نضج خلايا الكبد لزيادة مستويات NTCP11. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذا البروتوكول التمييز بين التأثير المثبط على دخول HBV كتثبيط لمرفق HBV مقابل تثبيط الاستيعاب. كما تم تعديل مقايسة امتصاص حمض التوروكوليك (TCA) باستخدام طريقة قائمة على ELISA بدلا من النظائر المشعة لتمثيل نقل NTCP12,13. تم تأكيد تفاعل المستقبلات والرباط من خلال هياكلها ثلاثية الأبعاد14,15. يمكن تقييم تثبيط وظيفة NTCP عن طريق قياس نشاط امتصاص TCA16. ومع ذلك ، لم تقدم هذه التقنية دليلا مباشرا على ارتباط NTCP بالمثبطات المرشحة. لذلك ، يمكن التحقيق في الارتباط باستخدام تقنيات مختلفة ، مثل رنين البلازمون السطحي 17 ، ELISA ، مقايسة التحول الحراري القائمة على التألق (FTSA) 18 ، FRET19 ، AlphaScreen ، وطرق أخرى مختلفة20. من بين هذه التقنيات ، يعد ITC معيارا للهدف في تحليل الربط لأنه يمكنه مراقبة امتصاص الحرارة أو انبعاثها في كل تفاعل تقريبا21. تم تقييم تقارب الربط (KD) ل NTCP والمركبات المرشحة مباشرة باستخدام ITC. كانت قيم التقارب هذه أكثر دقة من تلك التي تم الحصول عليها باستخدام نموذج التنبؤ في السيليكو 22.

يغطي هذا البروتوكول تقنيات نضوج خلايا الكبد ، وعدوى فيروس التهاب الكبد B ، وفحص مثبطات دخول فيروس التهاب الكبد B. باختصار ، تم تطوير نموذج خلايا الكبد على أساس خطوط خلايا imHC و HepaRG. تم تمييز الخلايا المستزرعة إلى خلايا كبدية ناضجة في غضون 2 أسابيع. تم الكشف عن تنظيم مستويات NTCP باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، واللطخة الغربية ، وقياس التدفق الخلوي11. تم إنتاج التهاب الكبد B virion (HBVcc) وجمعه من HepG2.2.15. تمت معالجة imHC أو HepaRG المتمايز (d-imHC ، d-HepaRG) بشكل وقائي مع المرشحين المضادين ل HBV قبل 2 ساعة من التلقيح ب HBV virion. كانت النتيجة المتوقعة للتجربة هي تحديد العوامل التي تقلل من فيروس التهاب الكبد B الخلوي والعدوى. تم تقييم نشاط مكافحة NTCP باستخدام مقايسة امتصاص TCA. يمكن منع نشاط NTCP بواسطة العوامل التي تربط NTCP على وجه التحديد. تم استخدام تقنية ITC للتحقيق في جدوى الارتباط التفاعلي الذي يمكن أن يتنبأ بالمثبطات والبروتينات المستهدفة ، وتحديد تقارب الارتباط (KD) لليجند للمستقبل عبر التفاعلات غير التساهمية للمركب الجزيئي الحيوي23,24. على سبيل المثال ، يمثل K D ≥ 1 × 103 mM ربطا ضعيفا ، ويمثل K D ≥ 1 × 106 μM ربطا معتدلا ، ويمثل K D ≤ 1 × 109 nM ارتباطا قويا. يرتبط ΔG ارتباطا مباشرا بالتفاعلات الملزمة. على وجه الخصوص ، التفاعل مع ΔG السلبي هو رد فعل مجهد ، مما يشير إلى أن الربط هو عملية عفوية. يشير التفاعل مع ΔH السالب إلى أن عمليات الارتباط تعتمد على الرابطة الهيدروجينية وقوى فان دير فال. يمكن استخدام كل من امتصاص TCA وبيانات ITC لفحص عوامل الدخول المضادة ل HBV. يمكن أن توفر نتائج هذه البروتوكولات أساسا ليس فقط للفحص المضاد لفيروس التهاب الكبد B ولكن أيضا للتفاعل مع NTCP كما تم تقييمه من خلال التقارب الملزم ووظيفة النقل. تصف هذه الورقة إعداد وتوصيف الخلية المضيفة ، والتصميم التجريبي ، وتقييم الإدخال المضاد ل HBV جنبا إلى جنب مع تقارب ربط NTCP.

Protocol

ملاحظة: يجب تنفيذ الإجراءات التالية في غطاء تدفق المخاطر البيولوجية من الفئة الثانية أو غطاء التدفق الصفحي. تمت الموافقة على التعامل مع HBV أخلاقيا من قبل IRB (MURA2020/1545). راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع الحلول والكواشف والمعدات وخطوط الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول….

Representative Results

لوحظت سمات النضج الكبدي ، بما في ذلك الخلايا ثنائية النواة والتشكل متعدد الأضلاع (الشكل 1) ، خاصة في المرحلة المتمايزة من imHC (الشكل 1 أ). تم قياس زيادة كبيرة في تعبير NTCP في d-HepaRG و d-imHC عند 7 أضعاف و 40 ضعفا على التوالي (الشكل 1B). تم الكشف عن الشكل عال…

Discussion

تبدأ عدوى HBV عن طريق الارتباط منخفض التقارب ببروتيوغليكان كبريتات الهيباران (HSPGs) على خلايا الكبد25 ، يليها الارتباط ب NTCP مع الاستيعاب الداخلي اللاحق من خلال الالتداخل الخلوي26. نظرا لأن NTCP هو مستقبل حاسم لدخول فيروس التهاب الكبد B ، يمكن ترجمة استهداف دخول HBV سريريا…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يتم دعم هذا المشروع البحثي من قبل جامعة ماهيدول وتايلاند للبحث العلمي والابتكار (TSRI) بشكل منفصل إلى A. Wongkajornsilp و K. Sa-ngiamsuntorn. تم دعم هذا العمل ماليا من قبل مكتب المجلس الوطني لسياسة البحث العلمي والابتكار في التعليم العالي من خلال وحدة إدارة البرنامج للقدرة التنافسية (رقم المنحة C10F630093). A. Wongkajornsilp هو المستفيد من منحة Chalermprakiat من كلية الطب مستشفى Siriraj ، جامعة ماهيدول. يود المؤلفون أن يشكروا الآنسة Sawinee Seemakhan (المركز الممتاز لاكتشاف الأدوية ، كلية العلوم ، جامعة ماهيدول) على مساعدتها في تقنية ITC.

Materials

Cell lines
HepaRG Cells, Cryopreserved Thermo Fisher Scientific HPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line Merck SCC249
Reagents
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution FUJIFLIM Wako chemical 163-20145
BD Perm/Wash buffer BD Biosciences 554723 Perm/Wash buffer
Cyclosporin A abcam 59865-13-3
EDTA Invitrogen 15575-038 8 mM
G 418 disulfate salt Merck 108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-free (100x) Thermo Scientific 78425
HEPES Merck 7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kits GE Healthcare 25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA Isolation Kit GE Healthcare 25-0500-71
ImProm-II Reverse Transcription System Promega A3800
KAPA SYBR FAST qPCR Kit Kapa Biosystems KK4600
Lenti-X Concentrator Takara bio PT4421-2 concentrator
Luminata crescendo Western HRP substrate Merck WBLUR0100
Master Mix (2x) Universal Kapa Biosystems KK4600
Nucleospin DNA extraction kit macherey-nagel 1806/003
Phosphate buffered saline Merck P3813
Polyethylene glycol 8000 Merck 25322-68-3
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo scientific P36930
Recombinant NTCP Cloud-Clone RPE421Hu02
RIPA Lysis Buffer (10x) Merck 20-188
TCA Sigma 345909-26-4
TCA Elisa kit Mybiosource MB2033685
Triton X-100 Merck 9036-19-5
Trypsin-EDTA Gibco 25200072 Dilute to 0.125%
Antibodies
    Anti-NTCP1 antibody Abcam ab131084 1:100 dilution
    Anti-GAPDH antibody Thermo Fisher Scientific AM4300 1:200,000 dilution
   HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody Abcam ab205718 1:10,000 dilution
   HRP goat anti-mouse secondary antibody Abcam ab97023 1:10,000 dilution
   Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11008 1:500 dilution
Reagent composition
1° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     Sodium azide Sigma 199931 Working concentration: 0.05%
Hepatocyte Growth Medium
      DME/F12 Gibco 12400-024
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
Hepatic maturation medium
      Williams’ E medium Sigma Aldrich W4125-1L
      10% FBS Sigma Aldrich F7524
      1% Pen/Strep HyClon SV30010
      1% GlutaMAX Gibco 35050-061
      5 µg/mL  Insulin Sigma Aldrich 91077C-100MG
      50 µM hydrocotisone Sigma Aldrich H0888-1g
     2% DMSO PanReac AppliChem A3672-250ml
IF Blocking solution
     1x PBS Gibco 21300-058
     3% BSA Sigma A7906-100G Working concentration: 3%
     0.2% Triton X-100 Sigma T8787 Working concentration: 0.2%
RIPA Lysis Buffer Solution Merck 20-188 Final concentration: 1X
     Protease Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 78425 Final concentration: 1X
       Na3VO4 Final concentration: 1 mM
       PMSF Final concentration: 1 mM
       NaF Final concentration: 10 mM
Western blot reagent
     10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Tween 20 Merck 9005-64-5
     1x TBST 0.1% Tween 20
     1x PBS Gibco 21300-058
     Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific A53225
     Polyacrylamide gel Bio-Rad 161-0183
     Ammonium Persulfate (APS) Bio-Rad 161-0700 Final concentration: 0.05%
    TEMED Bio-Rad 161-0800 Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%
    2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Final concentration: 1X
    Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 161-0374
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     5% Skim milk (nonfat dry milk) Bio-Rad 170-6404 Working concentration: 5%
1x Running buffer 1 L
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 14.4 g
     SDS Merck 7910 Working concentration: 0.1%
Blot transfer buffer 500 mL
      10x Tris-buffered saline (TBS) Bio-Rad 170-6435 Final concentration: 1X
     Glycine Sigma G8898 7.2 g
     Methanol Merck 106009 100 mL
Mild stripping solution 1 L Adjust pH to 2.2
    Glycine Sigma G8898 15 g
     SDS Merck 7910 1 g
     Tween 20 Merck 9005-64-5 10 mL
Equipments
15 mL centrifuge tube Corning 430052
50 mL centrifuge tube Corning 430291
Airstream Class II Esco 2010621 Biological safety cabinet
CelCulture CO2 Incubator Esco 2170002 Humidified tissue culture incubator
CFX96 Touch Real-Time PCR Detector Bio-Rad 1855196
FACSVerse Flow Cytometer BD Biosciences 651154
Graduated pipettes (10 mL) Jet Biofil GSP010010
Graduated pipettes (5 mL) Jet Biofil GSP010005
MicroCal PEAQ-ITC Malvern Isothermal titration calorimeters
Mini PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004 Electrophoresis chamber
Mini Trans-blot absorbent filter paper Bio-Rad 1703932
Omega Lum G Imaging System Aplegen 8418-10-0005
Pipette controller Eppendorf 4430000.018 Easypet 3
PowerPac HC Bio-Rad 1645052 Power supply
PVDF membrane Merck IPVH00010
T-75 A91:D106flask Corning 431464U
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-Rad 1703940 Semi-dry transfer cell
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130) Sonics & Materials
Versati Tabletop Refrigerated Centrifuge Esco T1000R Centrifuge with swinging bucket rotar
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levrero, M., Zucman-Rossi, J. Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).
  2. Kim, K. -. H., Kim, N. D., Seong, B. -. L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
  3. Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
  4. Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
  5. Mak, L. -. Y., Seto, W. -. K., Yuen, M. -. F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169 (2021).
  6. Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).
  7. Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
  8. Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
  9. Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
  10. Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).
  11. Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952 (2019).
  12. Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
  13. Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
  14. Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
  15. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  16. Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).
  17. Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
  18. Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
  19. Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
  20. Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
  21. Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
  22. Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
  23. Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).
  24. Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).
  25. Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
  26. Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).
  27. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  28. Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).
  29. Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
  30. Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
  31. Srivastava, V. K., Yadav, R., Misra, G. . Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. , 125-137 (2019).
  32. Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
  33. Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 3, 216 (2014).
  34. Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
  35. Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
  36. Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
  37. Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).

Tags

Hepatocyte ModelHepatitis B VirusNTCPViral EntryTherapeutic TargetEDTAParaformaldehydeTriton X-100Primary AntibodySecondary AntibodyFlow CytometryCompensation ControlsForward ScatterSide ScatterPMT Voltage

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sa-ngiamsuntorn, K., Thongsri, P., Pewkliang, Y., Borwornpinyo, S., Wongkajornsilp, A. A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target. J. Vis. Exp. (183), e63761, doi:10.3791/63761 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image