جيل قوي وقابل للتكرار للغاية من عضويات الدماغ القشرية لنمذجة الشيخوخة العصبية الدماغية في المختبر
Summary
في هذه الدراسة ، نقدم تقنية مفصلة لنظام زراعة عضوي قشري بسيط ولكنه قوي باستخدام ثقافات hPSC القياسية الخالية من التغذية. هذا بروتوكول سريع وفعال وقابل للتكرار لتوليد المواد العضوية التي تشكل جوانب شيخوخة الدماغ في المختبر.
Abstract
العضوية الدماغية هي نماذج ثلاثية الأبعاد للدماغ البشري النامي وتوفر منصة مقنعة ومتطورة لنمذجة الأمراض والفحص الجيني والأدوية على نطاق واسع. نظرا لطبيعة التنظيم الذاتي للخلايا في المواد العضوية في الدماغ والمجموعة المتزايدة من البروتوكولات المتاحة لتوليدها ، تم تحديد المشكلات المتعلقة بعدم التجانس والتباين بين المواد العضوية. في ورقة البروتوكول هذه ، نصف بروتوكولا قويا وقابلا للتكرار يتغلب إلى حد كبير على هذه المشكلات ويولد عضويات قشرية من أسلاف الجلد العصبي في غضون شهر 1 ، ويمكن الحفاظ عليه لأكثر من 1 سنة. يمكن تنفيذ هذا البروتوكول القابل للتكرار بسهولة في غرفة زراعة الأنسجة القياسية وينتج عنه عضويات مع تنوع غني من أنواع الخلايا الموجودة عادة في القشرة البشرية النامية. على الرغم من تركيبتها التنموية المبكرة ، ستبدأ الخلايا العصبية وأنواع خلايا الدماغ البشرية الأخرى في إظهار العلامات النموذجية للشيخوخة في الخلايا العصبية بعد فترة طويلة من الثقافة المخبرية ، مما يجعلها منصة قيمة ومفيدة لدراسة العمليات العصبية المرتبطة بالشيخوخة. يحدد هذا البروتوكول أيضا طريقة للكشف عن هذه الخلايا الشائخة في عضويات الدماغ القشرية باستخدام تلطيخ بيتا غالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة.
Introduction
استندت معرفتنا الحالية بالدماغ البشري إلى حد كبير على النماذج الحيوانية وعينات الدماغ بعد الوفاة. بيولوجيا الخلايا الجذعية هو مجال سريع التقدم يوفر رؤى جديدة في البيولوجيا الأساسية لنمو الدماغ البشري والدوافع المرضية لاضطرابات الدماغ البشري. الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) هي أداة لا تقدر بثمن لنمذجة الدماغ البشري عن طريق توليد المواد العضوية ، والأنسجة ثلاثية الأبعاد (3D) الشبيهة بالأعضاء التي تلخص عادة مسارات النمو ، والتركيب الخلوي ، وبنية الدماغ البشري النامي. يتم تجميع عضويات الدماغ ذاتيا وتتكون من خلايا جذعية عصبية ، وأسلاف عصبيين محددين ، وخلايا عصبية ناضجة ، وأنواع الخلايا الدبقية. وبالتالي ، توفر المواد العضوية فرصة فريدة لدراسة الدماغ البشري المبكر ، والذي غالبا ما يتعذر الوصول إليه لإجراء تجارب مباشرة ولكن له أيضا قيود جوهرية مثل عدم وجود الأوعية الدموية والجهاز المناعي.
تم اتباع منهجيات لتوليد المواد العضوية في الدماغ بطريقتين مختلفتين: التمايز غير الموجه والموجه. تعتمد طرق الدماغ العضوية غير الموجهة على قدرات التمايز الجوهرية التلقائية للخلايا الجذعية التي تدفع تكوين الأنسجة 1,2 وتسمح بظهور مجموعة متنوعة من هويات نسب الخلايا التي تتراوح من الدماغ الأمامي والدماغ المتوسط والدماغ الخلفي إلى الضفيرة المشيمية والشبكية والأديم المتوسط. في المقابل ، تتطلب طرق الدماغ العضوية الموجهة استخداما كبيرا للعوامل الخارجية لدفع hPSCs نحو النمط المطلوب للسلالات العصبية التي تمثل نوعا واحدا من مناطق الدماغ ، مثل البروز العقدي الإنسي3 ، والدماغ الأمامي4 ، والدماغ المتوسط5 ، وتحت المهاد6 ، والمخيخ7 ، والضفيرة المشيمية8. هذه القدرة على توليد مناطق مختلفة من الدماغ مع سلالات خلايا مختلفة ، وإمكانية دمجها حسب الرغبة ، تجعل من عضويات الدماغ نموذجا ممتازا للتحقيق في نمو الدماغ البشري وفك رموز الآليات الأساسية للأمراض المرتبطة بالدماغ. على الرغم من أن هذه الطرق لتوليد المواد العضوية في الدماغ تقدم طفرة في نمذجة مناطق الدماغ البشري ، إلا أن التباين وعدم التجانس بين المواد العضوية لا يزالان يشكلان قيدا كبيرا على الدراسات المنهجية والكمية ، مثل فحص الأدوية.
يعتمد البروتوكول الحالي على طريقة تم تطويرها في ورقتنا البحثية الأخيرة9 وتتضمن التمايز الانتقائي لمستعمرات hPSC نحو هوية الأديم العصبي (NEct) مع مثبطات SMAD المزدوجة (SB-431542 و LDN 193189) ، والتي لديها بعد ذلك القدرة على التنظيم الذاتي في غضون 4 أيام في كرويات الظهارة العصبية ثلاثية الأبعاد تحت تأثير إشارات FGF2. تولد هذه الظهارة العصبية كروية بشكل موثوق عضويات قشرية متجانسة مع تركيبة خلوية تشبه الجسم الحي في غضون 4 أسابيع من التمايز. البروتوكول الموصوف هنا مبني على النتائج السابقة التي توصلنا إليها والتي تبين أن تثبيط إشارات SMAD المزدوجة (مثبط الأمهات ضد Decapentaplegic) يعزز تمايز hPSCs نحو الخلايا الجذعية العصبية السطحية المشتقة من أسلاف الجلد العصبيالخارجي 10 عن طريق ، من بين أمور أخرى ، تثبيط اختيار مصير خلايا الجلد الباطن والجلد المتوسط والأديم التغذي11 . علاوة على ذلك ، فإن تضمين كرويات الظهارة العصبية في مصفوفة الغشاء السفلي المؤهل من قبل hESC يؤدي إلى ظهور كبير في الظهارة العصبية ، مما يشكل البطينين مع قطبية أبيكوبازية. أظهرت الثقافة واسعة النطاق قابلية التكاثر والتجانس للعضويات القشرية المستقلة عن خطوط الخلايا أو المستنسخات أو الدفعات ، وبالتالي تمثل نظاما موثوقا ومستقرا للخلايا الجذعية لمحاكاة التطور القشري البشري المبكر في الصحة والمرض في المختبر. كما أننا نحدد بروتوكولا للكشف عن علامات الخلايا العصبية الشائخة في عضويات الدماغ القشرية المشتقة من hPSCs والتي تم زراعتها لفترات طويلة من الزمن.
بعد طلاء hPSCs بكثافة بذر تتراوح بين 20٪ و 30٪ ، يتم التعامل مع الخلايا بمثبطات SMAD المزدوجة لمدة 3 أيام لتمييز مستعمرات hPSC نحو مستعمرات الجلد العصبي. ثم يتم رفع هذه المستعمرات بلطف مع dispase وبذورها في لوحات 6-well منخفضة للغاية المرفقة مع استكمال FGF2. المستعمرات العائمة ثنائية الأبعاد تنظم نفسها ذاتيا في كرويات ثلاثية الأبعاد عصبية بين عشية وضحاها ويتم الحفاظ عليها لمدة 4 أيام في وسط N2 تستكمل يوميا مع FGF2. بمجرد أن تنشئ الكرويات الطبقة الظهارية العصبية ، يمكن تضمينها في مصفوفة الغشاء السفلي. من خلال إضافة وسط تمايز طرفي جديد بشكل روتيني ، سيلاحظ الباحثون التوسع التدريجي والبهار الظهاري العصبي في المواد العضوية القشرية . قد يرغب الباحثون في فصل هذه المواد العضوية لإجراء التنميط النسخي والبروتيني. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بالتصوير الساطع لمراقبة جودة المواد العضوية القشرية . يمكن إجراء التحليل عن طريق التثبيت والاستئصال بالتبريد والتلطيخ المناعي. وقد سبق وصف أوصاف وأساليب هذه التقنيات12. في نهاية المطاف ، يسمح هذا البروتوكول للباحثين بتوليد عضويات دماغية قشرية متجانسة بسرعة وقوة لنمذجة الدماغ القشري البشري النامي ، بتكلفة منخفضة ومعدات محدودة ، ولدراسة جوانب الشيخوخة العصبية الخلوية ، كما هو موضح في هذه الورقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لتمكين استخدام المواد العضوية الدماغية المشتقة من hPSC في فحص الأدوية ونمذجة الأمراض ، من الأهمية بمكان صنع المواد العضوية باتباع بروتوكول15 قابل للتكرار وموثوق به. عادة ما يتم توليد عضويات الدماغ من الأجسام الجنينية المشتقة من hPSCs ، والتي يتم تضمينها بعد ذلك في مصفوفة خارج الخلية تعزز توسع الأنسجة والتمايز العصبي. عند مقارنتها ببروتوكولات مثل لانكستر1،16،17 و Velasco18 ، والتي تبدأ من الأجسام الجنينية وتسمح بمسار التمايز الافتراضي الذي تتبعه المواد العضوية النامية ، وجدنا أن البدء في إنشاء عضويات الدماغ القشرية مع خلايا NEct البشرية بدلا من الأجسام الجنينية يحسن اتساق تكوين العضوية القشرية في الدماغ. وبالتالي يسمح هذا أيضا بالتحجيم المطلوب لفحص الأدوية والنمط الظاهري. نظرا لأنه لا يمكن توسيع خلايا NEct البشرية إلى كميات كبيرة فحسب ، بل يمكن أيضا حفظها بالتجميد بسهولة ، فإن هذا النهج يحسن أيضا من قابلية التكرار بين التجارب. وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه بالمقارنة مع البروتوكولات الأخرى التي اعتمدت استخدام المفاعلات الحيوية والتكنولوجيات المماثلة، لا توجد حاجة إلى معدات متخصصة لهذا البروتوكول، مما يجعله مناسبا لأي مختبر6. وأخيرا ، يتم تقليل الوقت اللازم لتوليد المواد العضوية الناضجة التي تكون إيجابية لعلامات الطبقة القشرية مثل SATB2 مقارنة بكل من بروتوكولات لانكستر 1 والمفاعل الحيوي 6,19 مما يجعلها أكثر ملاءمة لدراسة المسار التنموي لتطور القشرة البشرية في الصحة والأمراض 1,6,16.
وعلاوة على ذلك، وبالنظر إلى تأثير الرعاية الصحية العالمية المتزايد باستمرار للأمراض المرتبطة بالشيخوخة مثل الخرف، والتي ترتبط بزيادة أنواع الخلايا الشائخة في الدماغ التي تسهم في الإمراض، فإن القدرة على تحديد واختبار المركبات التي يمكن أن تخفف من شيخوخة الدماغ هي ذات أهمية هائلة. على الرغم من أنه من المعروف أن hPSCs يتم تجديدها بشكل لاجيني خلال عملية إعادة البرمجة20 ، إلا أننا نجد زيادات قوية في الخلايا الشائخة في عضويات الدماغ القشرية المزروعة لفترات طويلة من الزمن. هذا تطور واعد يمكن الآن من فحص الأدوية التي تقضي على هذه الخلايا الشائخة من الدماغ (senolytics) أو التي تبطئ هذه العملية (senostatics)21. وبما أن عضويات الدماغ القشرية المشتقة من NEct البشري هي من أصل بشري ، فمن المرجح أن يؤدي هذا النهج إلى تقصير المسار التقليدي لتسويق مثل هذه العلاجات الجديدة.
هناك خطوتان حاسمتان في هذا البروتوكول. الأول هو المستوى الصحيح من التقاء مستعمرات hPSC في وقت التمايز. يجب أن تكون مستعمرات hPSC ملتقية بنسبة 30٪ على الأكثر لضمان عدم اندماج مستعمرات NEct المتولدة مع المستعمرات المجاورة وأن تكون المواد العضوية الفردية مدفوعة باستنساخ. تتضمن الخطوة الحرجة الثانية الاستخدام الصحيح للديسباز لرفع مستعمرات NEct وإنتاج الكرويات العصبية. توقيت الحضانة مع dispase أمر بالغ الأهمية للجودة النهائية للكرويات العصبية المتولدة. وذلك لأن التعرض المفرط للمستعمرات مع dispase سام للخلايا22 ويؤثر في النهاية على جودة المواد العضوية المتولدة. الحد من هذا البروتوكول هو أنه من الصعب التحكم في حجم الكرويات العصبية لأنه يعتمد على حجم المستعمرات الأولية التي يتم رفعها مع dispase. ومع ذلك ، يمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق اختيار الكرويات العصبية ذات الحجم المماثل عند المتابعة إلى مرحلة التضمين.
وأخيرا، يمكن أن تمتد التطبيقات المستقبلية إلى استخدام هذه المواد العضوية القشرية القابلة للتكرار في التحليل الروبوتي ونهج الفحص الصيدلاني الحيوي المستخدمة عادة في تلك الصناعة. ويدعم ذلك بيانات أولية من مختبرنا تشير إلى أن توليد عضويات الدماغ القشرية من خلايا NEct البشرية يمكن أن يكون آليا بسهولة ، مما يجعله متوافقا مع هذه الأساليب.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل من قبل صندوق مستقبل البحوث الطبية – البحوث المعجلة ، وبعثة ماسيمو الرائدة في حثل المادة البيضاء (EPCD000034) ، وصندوق مستقبل البحوث الطبية – بعثة الخلايا الجذعية (APP2007653). يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور جو هيون لي (جامعة كوريا) على توليد البيانات في الفيديو التكميلي 1.
Materials
| 16% Formaldehyde (W/V) Methanol-free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | 4% of PFA are diluted in 1x PBS |
| 2-Mercaptoethanol 50 mL(1000x) | Life Technologies Australia (TFS) | 21985023 | Used in NM and DM media |
| B 27 Supplement 10 mL | Life Technologies Australia (TFS) | 17504044 | Used in NM and DM media |
| CKX53 microscope with SC50 camera | Olympus | ||
| Corning Costar 6 well cell culture plates | Sigma Aldrich Pty Ltd | CLS3516-50EA | |
| Dispase II powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | Powder is dissolve in HBSS, filtered through 0.22 µm filter, aliquote at 10 mL and store at -20 °C |
| DMEM Nutrient Mix F12 10x 500 mL (DMEM/F-12) | Thermofisher | 11320082 | Used in NM and DM media |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich Pty Ltd | D2650-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich Pty Ltd | D1408-500ML | |
| Falcon Matrigel hESC-qualified Matrix | In Vitro Technologies Pty Ltd | FAL354277 | Make aliquotes of 100 µL and stored at -20 °C |
| GlutaMAX Supplement 100x | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used in NM and DM media |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich Pty Ltd | H8264 | |
| Human induced pluripotent stem cells (EU79) | In-house reporogrammed from skin fibroblast | ||
| Human induced pluripotent stem cells (G22) | Genea Biocells | Obtained from Genea Biocells (San Diego, United States) | |
| Human induced pluripotent stem cells (WTC) | Gift from Professor Bruce Conklin | ||
| InSolution TGF-Β RI Kinase Inhibitor VI, SB431542 | Merck | US1616464-5MG | |
| Insulin Solution Human Recombinant | Sigma Aldrich Pty Ltd | I9278 | Used in NM and DM media |
| LDN193189 Dihydrochloride | Sigma Aldrich Pty Ltd | SML0559-5MG | Used during differentiation |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used in NM and DM media |
| mTeSR Plus | STEMCELL TECHNOLOGIES | 100-0276 | Used to maintain hiPSC colonies prior to differentiation with NM media |
| N2 Supplement 5 mL (100x) | Life Technologies Australia Pty Ltd | 17502048 | Used in NM and DM media |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Used in DM media |
| OCT Embedding Compound Sakura Clear (118 mL/Bottle) | Tissue Tek | 4583 | |
| Parafilm M Roll Size 4 in. x 125 Ft | Sigma Aldrich Pty Ltd | P7793 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used in NM and DM media |
| Potassium Hexacyanoferrate (II) Trihydrate | Sigma Aldrich Pty Ltd | CP1087 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 455946 | |
| Prolong Glass Antifade Mountant | Life Technologies Australia (TFS) | P36980 | |
| Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-01M | Aliquotes are made at 20 µg/mL and stored at -20 °C |
| SB431542 | Tocris | 1614 | Used during differentiation |
| Sucrose | Sigma Aldrich Pty Ltd | PHR1001-1G | 30% of sucrose are diluted in 1x PBS |
| Ultra-Low attachment multiwell plates , 24 well plate, polystyrene | Sigma Aldrich Pty Ltd | CLS3473-24EA | |
| X-GAL EA | Life Technologies Australia (TFS) | R0404 | Make aliquotes of 20 mg/mL and storde at -80 °C |
References
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
- Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).
- Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-Strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nature Methods. 14 (7), 743 (2017).
- Kwak, T. H., et al. Generation of homogeneous midbrain organoids with in vivo-like cellular composition facilitates neurotoxin-based Parkinson’s disease modeling. Stem Cells. 38 (6), 727-740 (2020).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Shaker, M. R., Cooper-White, J., Wolvetang, E. J. Self-organizing 3D human choroid plexus-ventricle-cortical organoids. BioRxiv. , (2020).
- Shaker, M. R., Aguado, J., Chaggar, H. K., Wolvetang, E. J. Klotho inhibits neuronal senescence in human brain organoids. npj Aging and Mechanisms of Disease. 7 (1), 1-12 (2021).
- Shaker, M. R., et al. Anteroposterior Wnt-RA gradient defines adhesion and migration properties of neural progenitors in developing spinal cord. Stem Cell Reports. 15 (4), 898-911 (2020).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Shaker, M. R., et al. Rapid and efficient generation of myelinating human oligodendrocytes in organoids. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 631548 (2021).
- Lee, J. -. H., Shaker, M. R., Lee, E., Lee, B., Sun, W. NeuroCore formation during differentiation of neurospheres of mouse embryonic neural stem cells. Stem Cell Research. 34, 101691 (2020).
- Shaker, M. R., et al. Spatiotemporal contribution of neuromesodermal progenitor-derived neural cells in the elongation of developing mouse spinal cord. Life Sciences. 282, 119393 (2021).
- Shaker, M. R., et al. Neural epidermal growth factor-like like protein 2 Is expressed in human oligodendroglial cell types. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 803061 (2022).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Hunter, Z. L., Leeson, H. C., Shaker, M. R., Wolvetang, E. J., Vadlamudi, L. Human induced pluripotent stem cells generated from epilepsy patients for use as in vitro models for drug screening. Stem Cell Research. 60, 102673 (2022).
- Kaur, A., Macip, S., Stover, C. M. An appraisal on the value of using nutraceutical based senolytics and senostatics in aging. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 218 (2020).
- Wang, F., et al. Safety and efficacy of dispase and plasmin in pharmacologic vitreolysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (9), 3286-3290 (2004).
