インビトロでの脳ニューロン老化のモデリングのための皮質脳オルガノイドの堅牢で再現性の高い生成

ここでは、研究者が培養後1〜3ヶ月以内に in vivo ヒト皮質脳領域を模倣する均質なhPSC由来皮質脳オルガノイドを生成することを可能にする堅牢なプロトコルについて説明した。hPSCコロニーは、まず分化培地中で培養して神経外胚葉性コロニーを生成し、次いで神経スフェロイドを形成するために使用することができる。これらのスフェロイドは、その後、基底膜マトリックスに埋め込まれ、長期間維持されて、ニューロンの老化をモデル化するために使用できるオルガノイドを生成する(プロトコルの概要については 、図1 を参照)。これらのオルガノイドを超コーティングされていない24ウェルプレートで培養すると、細胞ストレスを引き起こし、13週間の in vitro培養で 老化関連表現型を促進することは注目に値します。このプロトコールに由来するオルガノイドは、皮質プレート神経細胞の最適な増殖および分化のために、または気液界面で、攪拌バイオリアクター内で維持することもできる。 まず、hPSCコロニーを神経外胚葉分化の前に1日間培養する。これらのhPSCコロニーは、わずか20%〜30%のコンフルエント度で培養され、可能な限り最高の品質、すなわちコロニーを汚染する分化細胞のないタイトな平坦な単層であることが重要です(図2A、B)。hPSCコロニーの多能性は、NANOGなどのマーカーの発現によって確認されるべきである(図2C)。次いで、検証されたhPSCコロニーを、SB-431542およびLDN 193189を有するN2神経外胚葉性分化培地に曝露する。この培地での3日間の維持の後、hPSCコロニーは神経外胚葉性コロニーに分化し、もはやhPSCの同じタイトな平坦な単層形態を示さず(図2B)、むしろ、それらはより長い柱状細胞になる(図2B)。これらの細胞はまた、NANOGなどの多能性マーカーに対して陰性である(図2C)。 神経外胚葉性コロニーが異種で酵素的に剥離され、健常で首尾よく剥離したコロニーが自己組織化され、若い神経スフェロイドを形成することができるのはこの段階である(図2D、補足ビデオ1)。健康で清潔な神経外胚葉性コロニーのみが、ディスパーゼ活性に指定された時間枠内に剥離する。他のすべてのコロニーは、スフェロイドの品質が低くなるため、無視する必要があります。N2培地中のFGF2に毎日曝露されると、これらのスフェロイド(図2D、1日目)の神経幹細胞(SOX2+)は増殖し、かなりの数の神経ロゼットを形成する(図2D、4日目)。これらのロゼットは、ロゼットの中心内および回転楕円体の外縁に沿って位置する細胞においてタイトジャンクションおよび上皮マーカーZO1を発現し、回転楕円体の頂端 – 基底極性を示す(図2D、4日目)。回転楕円体のホールマウント3Dイメージングの方法は、13の前に説明されている。スフェロイドの毎日の検査は、スフェロイドのタイトで暗い外縁および明るい周辺部の形成を解明するはずであり、これは神経上皮層である。この層は、3〜4日後におよそ500μmの直径で十分に形成されるべきであり、その時点で回転楕円体を基底マトリックスに埋め込むことができる。この層が存在しないか、または弱く形成されているだけの場合、スフェロイドは前進するのに十分に発達していない。変化を観察するために別の日を待つことをお勧めしますが、これが観察されない場合は、これらの回転楕円体を無視してください。 培養3日後のスフェロイドの代表的な明視野像を 図2Dに見ることができる。他の隣接するスフェロイドと融合しておらず、半透明の組織を有し、神経ロゼット形成を示す、タイトな神経上皮層を有するスフェロイドは、地下マトリックスに埋め込まれるように選択される。一旦埋め込まれると、回転楕円体は急速に増殖し、出芽を開始する:コンパクトな組織の節が現れ、回転楕円体の本体から外側に広がる。これは、地下マトリックス中で1〜3週間の間に明らかであり、複数の細胞株にわたって観察することができる(図3A)。埋め込まれたスフェロイドの定量分析により、3つの異なる細胞株にわたって最大100%のスフェロイドに上皮細胞が存在することを確認し、このプロトコルから期待される均質性と再現性を確認しました(図3B)。 in vitro 分化中のオルガノイド直径の定量化は、hPSCの異なるラインにわたる再現性をさらに確認する(図3C)。出芽が起こらなければ、回転楕円体は適切に発達しておらず、廃棄されるべきである。スフェロイドがマトリックスに埋め込まれると、その発達が進み、スフェロイドはオルガノイドと呼ばれるようになりました。免疫蛍光染色はまた、神経前駆細胞(PAX6)ならびにCTIP2およびSATB2で染色された皮質層マーカーの存在を、明確な層状を有するオルガノイド中に確認する(図3D、E)。この層状化は、オルガノイド維持の異なる時点にわたって観察可能である(図3D、E)。組織の免疫組織化学の方法は、前に14に記載されてきた。 これらのオルガノイドの1つの可能な用途は、ニューロンの老化関連プロセスが脳にどのように影響するかを研究することである。これを調べるために、首尾よく生成されたオルガノイドは、老化関連β−ガラクトシダーゼおよびp21などの老化の標準的な分子バイオマーカーの切片化および染色のために、複数の異なる時点から採取される。 図4Aは 、基底膜マトリックスに包埋してから4および13週間後のオルガノイドの老化関連β−ガラクトシダーゼ染色の代表的な画像を示す。4週目から13週目の間に、老化関連β-ガラクトシダーゼの存在が著しく増加しており、生物老化の認識されたドライバーである細胞老化が培養においてこの時間にわたって起こったことが示唆される。13週目におけるオルガノイドの免疫蛍光染色は、成熟皮質ニューロンマーカー(CTIP2)で共標識された別の老化マーカーp21の存在を確認し、 図4Bに見ることができる。しかしながら、p21の存在は細胞周期停止のマーカーであり、それ自体は老化の決定的なマーカーではなく、p16およびSASP(老化関連分泌表現型)因子などの他の老化マーカーの検出は、細胞を老化として決定的に同定するために推奨されることに留意すべきである。 図1:再現可能な皮質脳オルガノイドを生成するための模式図。フィーダーフリー培地中に維持されたhPSCsからの皮質脳オルガノイドの生成のための実験手順の概略ワークフロー。このワークフローでは、2D hPSCをオルガノイド中の3Dパターン化された皮質プレートヒト組織に区別するために必要な6つのステップの概要を提供します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:神経外胚葉性コロニー-hPSCに由来する神経スフェロイドの生成 (A)最適(ホワイトダニ)および分化コロニー(白十字)を示すヒトPSCの代表的な画像。スケールバー:200μm、倍率4倍。(b)二重SMAD阻害剤治療の3日後のhPSCsに由来する神経外胚葉性コロニーの代表的な画像。スケールバー:200μm、倍率4倍。(c)ヒトPSCコロニーを神経外胚葉性コロニーに向けて分化させた。画像は、SOX2(赤色)、NANOG(緑色)でPSC(1日目)および神経外胚葉性(3日目)コロニーの染色を表し、全ての核はヘキスト33342(青色)で対比染色した。スケールバー:40μm、倍率100倍。(d)明視野下での インビトロ 培養における皮質脳スフェロイドの経時的な発達段階を示す画像、および1日目にSOX2(赤)で免疫染色されたホールマウント、および4日目にSOX2(赤)およびZO1(緑)で二重免疫染色した。明視野画像のスケールバーは500μm、倍率は4倍、下部画像のスケールバーは倍率40μm、倍率20倍である。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:異なるhPSCラインに由来する皮質脳オルガノイドの特性評価(A)インビトロで3週間にわたって培養されたG22、WTC、およびEU79ヒトiPSCラインに由来する皮質脳オルガノイドの代表的な画像。すべての画像のスケールバーは500μm、倍率2倍です。(B)異なるhPSC株(G22、WTC、およびEU79)における3週間のin vitro分化における皮質脳オルガノイドの生成の成功率。N = 3。データは平均±標準偏差として表示されます。(c)ヒト多能性幹細胞株(G22、WTC、およびEU79)の異なる株におけるインビトロ分化の1週目および3週目における皮質脳オルガノイドの成長(平均直径に基づく)を示す棒グラフ。N = 3。データは平均±標準偏差として表示されます。(d)心室帯PAX6(赤)および皮質プレートCTIP2(緑)について免疫染色されたG22 hPSCに由来する6週齢および9週齢の皮質脳オルガノイドの切片の代表的な画像。全ての切片をヘキスト33342(青色)で対比染色した。スケールバー= 140μm、倍率20倍。W は週です。(e)皮質層IV SATB2について免疫染色したWTC hPSCsに由来する10週齢および13週齢の皮質脳オルガノイドの切片の代表的な画像(緑色)。全ての切片をヘキスト33342(青色)で対比染色した。10週間画像スケールバー=50μm、倍率40倍。13週間画像スケールバー=150μm、倍率40倍。W は週です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:hPSCsに由来する皮質脳オルガノイドにおける老化の特徴付け(A)インビトロで4週間および13週間培養し、SA-β-galで染色したWTC hPSCに由来するヒト皮質脳オルガノイドの切片の代表的な画像。スケールバー = 500 μm、ズーム画像のスケールバー = 250 μm、倍率4倍。点線のボックスは拡大画像を示します。(b)皮質ニューロンCTIP2(緑)およびp21(赤)について免疫染色されたヒトEU79 hPSCsに由来する13週齢の皮質脳オルガノイドの切片の代表的な画像。すべての切片をヘキスト33342(青)で対比染色した。スケールバー= 25μm、ズーム画像のスケールバー= 10μm、倍率40倍。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 メディアコンポーネント 濃度 DMEM 栄養ミックス F12 10x 500 mL (DMEM/F-12) N2 サプリメント 5 mL (100x) 1%で支持 B 27 サプリメント 10 mL 2%で補充 MEM非必須アミノ酸溶液(100倍) 1%で補充 ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL) 1%で補充 2-メルカプトエタノール 50mL(1000x) 0.1%で補充 表1:N2ミディアムこの表は、N2培地を調製するために必要な試薬をリストしています。 メディアコンポーネント 濃度 DMEM 栄養ミックス F12 10x 500 mL (DMEM/F-12) DM培地は、DMEM/F12とニューロ基底培地の1:1の比率で作られています 神経基底培地 N2 サプリメント 5 mL (100x) 0.5%で維持 B 27 サプリメント 10 mL 1%で補充 MEM非必須アミノ酸溶液(100倍) 1%で補充 グルタマックスサプリメント100倍 1%で補充 ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL) 1%で補充 インスリン溶液ヒト組換え体 12.5 μL (50 mL の培地) 2-メルカプトエタノール 50mL (1000x) 17.5 μL (50 mL の培地) 表2:分化培地(DM)。 表は、分化培地を調製するために必要な試薬を列挙する。 補足ビデオ 1.bFGFの治療下で誘導されたhNEct 2Dシート/コロニーの3Dへの変換のライブイメージング。hNEctの誘導コロニーを、上記で概説したようにディスパーゼでディッシュから穏やかに剥離し、低付着6ウェル培養プレートに移した。2D hNEctコロニーは、12時間以内に3D hNEctスフェロイドに変換された。シリアル画像は5分ごとにキャプチャされました。スケール バー = 100 μm。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。