İmmünkompetan Farelerin Beyinde Non-invaziv Transnazal Yolla İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Mikroglia Transplantasyonu

Bu çalışmada kullanılan tüm hayvanlar, Japonya Fizyoloji Derneği20 tarafından yayınlanan “Fizyolojik Bilimler Alanında Hayvanların Bakımı ve Kullanımında Yol Gösterici İlkeler” e uygun olarak ve Yamanashi Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi’nin daha önce onayı ile elde edilmiş, barındırılmış, bakımı yapılmış ve kullanılmıştır (Yamanashi, Japonya). 1. Hücre ortamı, transplantasyon ortamı ve anestezi karışımının hazırlanması DMEM’e fetal sığır serumu ve %0.1 penisilin/streptomisin ekleyerek hücre ortamını hazırlayın. Hücre ortamına hCSF1 (250 ng/mL) ve hTGF-β1 (100 ng/mL) ekleyerek transplantasyon ortamını hazırlayın. Anestezi karışımını intraperitoneal enjeksiyon için 0.45 mL medetomidin hidroklorür, 1.2 mL midazolam ve 1.5 mL butorphanol tartarat 11.8 mL normal salin içinde karıştırarak hazırlayın. 2. iPSMG’nin hazırlanması NOT: Dondurulmuş iPSMG (Malzeme Tablosu) kullanıma kadar -80 °C’de tutulmuştur. Donmuş hücreleri 37 ° C’lik bir su banyosunda hızlı bir şekilde çözün. Tüm görünür buzlar eriyene kadar örnekleri döndürün. Çözülmüş iPSMG’yi 37 °C’ye ısıtılmış kültür ortamına ekleyin. Kültür ortamının 10 mL’sine ortam içeren 1 mL çözülmüş hücre (1 × 106 hücre) ekleyin. Bir hücre peleti elde etmek için hücreleri 300 x g’da 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini rahatsız etmeden tüm süpernatantları çıkarın. Transplantasyon ortamındaki sitokin konsantrasyonunun seyreltilmesini azaltmak için süpernatantın tamamen çıkarılması arzu edilir. 1 x 105 hücre/μL’lik bir hücre konsantrasyonu elde etmek için transplantasyon ortamını ekleyin. İPSMG’yi buzun üzerine yerleştirin ve hemen transplantasyona devam edin.NOT: Transplantasyon için iPSMG hazırlanması, kontaminasyonu önlemek için temiz bir tezgahta gerçekleştirilir. 3. Transnazal transplantasyon için farenin hazırlanması (Tsn) Vahşi tip erkek fareleri (C57BL / 6J, 8 haftalık) 7 gün boyunca PLX5622 içeren diyetle besleyin. 7. günün sonunda, PLX diyetini durdurun ve fareleri çalışmanın sonuna kadar normal bir diyetle besleyin.NOT: PLX5622 içeren diyet, 1 kg AIN-93G’ye (Malzeme Tablosu) 1.2 g PLX5622 eklenerek hazırlanır. 4. Transnazal hücre nakli PLX beslemesinin kesilmesinden 24 saat sonra, fareleri tartın ve anestezi karışımının intraperitoneal enjeksiyonunu (0.2 mL / 20 g) kullanarak anestezi yapın. Fareler, pedal çekme refleksine (sert ayak parmağı sıkışması) yanıt vermeme ile değerlendirildiği gibi tamamen uyuşturulduktan sonra, burun mukozasının geçirgenliğini arttırmak için 10 μL’lik bir pipet ucu kullanarak her burun deliğine iPSMG’nin Tsn’sinden önce 1 saatte PBS’de (100 U / mL) 2.5 μL hyaluronidaz uygulayın. Hyaluronidaz uygulamasından sonra, fareleri sırtüstü pozisyona getirin. iPSMG’nin transnazal transplantasyonundan 10 dakika önce adım 4.2’yi tekrarlayın. 10 μL’lik pipet ucu kullanarak farenin bir burun deliğine 2,5 μL hücre süspansiyonu uygulayın. Diğer burun deliğine hücre süspansiyonu uygulanmadan önce fareyi 5 dakika boyunca sırtüstü pozisyonda yerleştirin. 4,5 ve 4,6 numaralı adımları dört kez tekrarlayın ve hayvan başına toplam 20 μL hacim uygulayın. Anesteziden kurtulana kadar fareyi 37 °C’lik bir ısı yastığına sırtüstü pozisyonda yerleştirin. PLX beslemesinin kesilmesinden 48 saat sonra, aynı farelerde 4.1-4.7 adımlarını bir kez daha tekrarlayın.NOT: Transplantasyon sırasında iPSMG’nin buz üzerine yerleştirildiğine dikkat edilmelidir. 5. Sitokinlerin uygulanması Fareleri intraperitoneal anestezi karışımı enjeksiyonu (0.2 mL / 20 g) ile anestezi altına alın. 10 μL’lik bir pipet ucu kullanarak nakil ortamının 2,5 μL’sini farenin bir burun deliğine uygulayın. Transplantasyon ortamını diğer burun deliğine uygulamadan önce fareyi 5 dakika boyunca sırtüstü pozisyonda tutun. 5,2 ve 5,3 numaralı adımları dört kez yineleyin ve hayvan başına toplam 20 μL hacim uygulayın.NOT: Transplantasyon ortamının (insan sitokinleri) transnazal uygulamasının, transplante edilen iPSMG’nin çalışmanın sonuna kadar yaşayabilirliği için her 12 saatte bir gerekli olduğu unutulmamalıdır.