השתלה של מיקרוגליה שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם במוח עכברים מדוכאי חיסון דרך נתיב טרנסנסאלי לא פולשני

כל בעלי החיים ששימשו במחקר זה הושגו, שוכנו, טופלו ונעשה בהם שימוש בהתאם ל”עקרונות המנחים בטיפול ובשימוש בבעלי חיים בתחום המדעים הפיזיולוגיים” שפורסמו על ידי האגודה הפיזיולוגית של יפן20, ובאישור הקודם של הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת יאמאנאשי (יאמאנאשי, יפן). 1. הכנת מדיום תאים, מדיום השתלה ותערובת הרדמה הכינו את מדיום התא על ידי הוספת 10% סרום בקר עוברי ו-0.1% פניצילין/סטרפטומיצין ב-DMEM. הכן את מדיום ההשתלה על ידי הוספת hCSF1 (250 ng/mL) ו- hTGF-β1 (100 ng/mL) למדיום התא. הכינו את תערובת ההרדמה להזרקה תוך-צפקית על ידי ערבוב של 0.45 מ”ל של מדטומידין הידרוכלוריד, 1.2 מ”ל של מידזולם ו-1.5 מ”ל של טרטרט בוטורפאנול ב-11.8 מ”ל של מי מלח רגילים. 2. הכנת iPSMG הערה: iPSMG קפוא (טבלת חומרים) נשמרו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. להפשיר את התאים הקפואים במהירות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. סובבו את הדגימות עד שכל הקרח הנראה נמס. הוסיפו את ה-iPSMG המופשר למדיה התרבותית שחוממה ל-37 מעלות צלזיוס. הוסיפו 1 מ”ל של תאים מופשרים המכילים מדיום (1 × 106 תאים) ל-10 מ”ל של מדיית התרבית. צנטריפוגה של התאים ב 300 x g במשך 5 דקות כדי לקבל גלולת תא. לאחר צנטריפוגה, הסר את כל הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדור התא. הסרה מלאה של סופרנטנט רצויה כדי להפחית את דילול ריכוז הציטוקינים במדיום ההשתלה. הוסף את מדיום ההשתלה כדי לקבל ריכוז תאים של 1 x 105 תאים / μL. מניחים את ה-iPSMG על הקרח ומיד ממשיכים להשתלה.הערה: הכנת iPSMG להשתלה מתבצעת על ספסל נקי כדי למנוע זיהום. 3. הכנת עכבר להשתלת טרנסנסאל (Tsn) האכילו את העכברים הזכרים מסוג בר (C57BL/6J, בני 8 שבועות) עם PLX5622 המכיל תזונה למשך 7 ימים. בסוף היום השביעי, להפסיק אתדיאטת PLX ולהאכיל את העכברים בתזונה רגילה עד סוף המחקר.הערה: PLX5622 המכילה דיאטה מוכנה על ידי הוספת 1.2 גרם של PLX5622 ב 1 ק”ג של AIN-93G (טבלת חומרים). 4. השתלה טרנסנסאלית של תאים 24 שעות לאחר הפסקת ההזנה של PLX, שוקלים את העכברים ומרדימים אותם באמצעות הזרקה תוך-צפקית של תערובת ההרדמה (0.2 מ”ל/20 גרם). לאחר שהעכברים מורדמים לחלוטין כפי שהוערך על ידי חוסר תגובה לרפלקס הגמילה מהדוושה (צביטה חזקה בבוהן), תנו 2.5 μL של היאלורונידאז ב-PBS (100 U/mL) בשעה אחת לפני Tsn של iPSMG לכל נחיר פעמיים באמצעות קצה פיפטה של 10 μL כדי להגביר את החדירות של רירית האף. לאחר היישום של hyaluronidase, למקם את העכברים במצב שכיבה. חזור על שלב 4.2 10 דקות לפני השתלת טרנסנסאל של iPSMG. יש למרוח 2.5 μL של תרחיף התא על נחיר אחד של העכבר באמצעות קצה פיפטה של 10 μL. מניחים את העכבר במצב שכיבה למשך 5 דקות לפני מתן השעיית התא לנחיר השני. חזור על שלבים 4.5 ו- 4.6 ארבע פעמים, תוך החלת נפח כולל של 20 μL לכל חיה. מניחים את העכבר במצב שכיבה על משטח חום של 37 מעלות צלזיוס עד להתאוששות מהרדמה. בשעה 48 שעות לאחר הפסקת האכלת PLX, חזור שוב על שלבים 4.1-4.7 על אותם עכברים.הערה: יש לציין כי iPSMG ממוקמים על קרח במהלך ההשתלה. 5. יישום ציטוקינים מרדימים את העכברים על ידי הזרקה תוך-צפקית של תערובת הרדמה (0.2 מ”ל/20 גרם). יש למרוח 2.5 μL של מדיום ההשתלה על נחיר אחד של העכבר באמצעות קצה פיפטה של 10 μL. מניחים את העכבר בתנוחת השכיבה למשך 5 דקות לפני מתן מדיום ההשתלה לנחיר השני. חזור על שלבים 5.2 ו- 5.3 ארבע פעמים, תוך החלת נפח כולל של 20 μL לכל חיה.הערה: יש לציין כי מתן טרנסנסאלי של מדיום השתלה (ציטוקינים אנושיים) נדרש כל 12 שעות עבור הכדאיות של iPSMG מושתל עד סוף המחקר.