Transplantatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide microglia in immunocompetente muizenhersenen via niet-invasieve transnasale route

Alle dieren die in deze studie werden gebruikt, werden verkregen, gehuisvest, verzorgd en gebruikt in overeenstemming met de “Guiding Principles in the Care and Use of Animals in the Field of Physiologic Sciences” gepubliceerd door de Physiologic Society of Japan20, en met de voorafgaande goedkeuring van de Animal Care Committee van de Universiteit van Yamanashi (Yamanashi, Japan). 1. Bereiding van celmedium, transplantatiemedium en anesthesiemengsel Bereid het celmedium voor door 10% foetaal runderserum en 0,1% penicilline/streptomycine toe te voegen aan DMEM. Bereid het transplantatiemedium voor door hCSF1 (250 ng/ml) en hTGF-β1 (100 ng/ml) aan het celmedium toe te voegen. Bereid het anesthesiemengsel voor intraperitoneale injectie door 0,45 ml medetomidinehydrochloride, 1,2 ml midazolam en 1,5 ml butorphanoltartraat te mengen in 11,8 ml normale zoutoplossing. 2. Bereiding van iPSMG OPMERKING: Bevroren iPSMG (Table of Materials) werd tot gebruik bij -80 °C bewaard. Ontdooi de bevroren cellen snel in een waterbad van 37 °C. Draai de monsters totdat al het zichtbare ijs is gesmolten. Voeg de ontdooide iPSMG toe aan het tot 37 °C verwarmde kweekmedium. Voeg 1 ml ontdooide cellen met medium (1 × 106 cellen) toe aan 10 ml van de kweekmedia. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g om een celkorrel te verkrijgen. Verwijder na het centrifugeren alle supernatant zonder de celkorrel te verstoren. Volledige verwijdering van supernatant is wenselijk om verdunning van de cytokineconcentratie in het transplantatiemedium te verminderen. Voeg het transplantatiemedium toe om een celconcentratie van 1 x 105 cellen/μL te verkrijgen. Plaats de iPSMG op ijs en ga onmiddellijk over tot transplantatie.OPMERKING: De voorbereiding van iPSMG voor transplantatie wordt uitgevoerd op een schone bank om besmetting te voorkomen. 3. Voorbereiding van de muis voor transnasale transplantatie (Tsn) Voer de wilde mannelijke muizen (C57BL/6J, 8 weken oud) gedurende 7 dagen met PLX5622 met een dieet. Aan het einde van de7e dag, stop het PLX-dieet en voed de muizen met een normaal dieet tot het einde van de studie.OPMERKING: PLX5622 bevattende voeding wordt bereid door toevoeging van 1,2 g PLX5622 in 1 kg AIN-93G (Tabel van materialen). 4. Transnasale transplantatie van cellen 24 uur na het stoppen van PLX-voeding, weeg de muizen en verdoof ze met behulp van een intraperitoneale injectie van het anesthesiemengsel (0,2 ml / 20 g). Nadat de muizen volledig zijn verdoofd, zoals beoordeeld door niet-responsiviteit op pedaalontwenningsreflex (stevige teenknijp), dient u tweemaal 2,5 μL hyaluronidase in PBS (100 U / ml) toe vóór Tsn iPSMG aan elk neusgat toe met behulp van een pipetpunt van 10 μL om de permeabiliteit van het neusslijmvlies te verhogen. Plaats na het aanbrengen van hyaluronidase de muizen in rugligging. Herhaal stap 4.2 10 min voor de transnasale transplantatie van iPSMG. Breng 2,5 μL celsuspensie aan in één neusgat van de muis met behulp van een pipetpunt van 10 μL. Plaats de muis gedurende 5 minuten in rugligging voordat de celsuspensie aan het andere neusgat wordt toegediend. Herhaal stap 4.5 en 4.6 vier keer en breng een totaal volume van 20 μL per dier aan. Plaats de muis in rugligging op een warmtekussen van 37 °C totdat de anesthesie is hersteld. Herhaal na 48 uur na het stoppen van PLX-voeding stap 4.1-4.7 opnieuw op dezelfde muizen.OPMERKING: Opgemerkt moet worden dat iPSMG tijdens de transplantatie op ijs wordt geplaatst. 5. Toepassing van cytokines Verdoof de muizen door een intraperitoneale injectie van het anesthesiemengsel (0,2 ml / 20 g). Breng 2,5 μL van het transplantatiemedium aan in één neusgat van de muis met behulp van een pipetpunt van 10 μL. Plaats de muis gedurende 5 minuten in rugligging voordat u het transplantatiemedium aan het andere neusgat toedient. Herhaal stap 5.2 en 5.3 vier keer en breng een totaal volume van 20 μL per dier aan.OPMERKING: Opgemerkt moet worden dat transnasale toediening van transplantatiemedium (menselijke cytokines) elke 12 uur nodig is voor de levensvatbaarheid van getransplanteerde iPSMG tot het einde van het onderzoek.