Sondes d’attache de jauge de tension pour quantifier la mécanique et l’adhérence de l’intégrine médiée par le facteur de croissance

1. Préparation d’oligonucléotides TGT REMARQUE: Les détails de la synthèse de la sonde oligonucléotidique sont décrits ici. Veuillez noter que certaines modifications et étapes de purification peuvent être externalisées pour une synthèse personnalisée. Activer l’amine primaire du peptide cyclo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(PEG-PEG)] avec le liant azide-NHS tel que décrit par Zhang et al22 en mélangeant dans un rapport 1:1,5 (100:150 nmoles) dans un volume final de 10 μL de diméthylformamide. Ajouter 0,1 μL de la base organique triéthylamine et incuber pendant 12 h à 4°C. Purifier le produit par CLHP en phase inverse en utilisant 0,1 M TEAA (solvant A) et 100% acétonitrile (solvant B) avec un débit de 1mL/ min et la condition initiale de 10% solvant B réglé à un gradient de 0,5%/min. Combiner les pics élués (absorbance à 203 nm) et vérifier par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Le produit est cRGDfK-azide. Pour générer le brin supérieur TGT, combinez l’azoture cRGDfK et l’oligonucléotide alcyne-21-BHQ2 (brin supérieur TGT: 5Hexynyl/GTGAAATACCGCACAGATGCG/3BHQ_2) dans un rapport de 2:1 (͂200 μM: 100 μM) dans 100 μL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 5 mM d’ascorbate de sodium et 0,1 μM de Cu-THPTA préformé. Laisser la réaction se poursuivre pendant au moins 4 h à température ambiante (RT) ou pendant la nuit à 4 °C. Traiter le mélange à travers le gel de dessalage P2 pour éliminer l’excès de colorant, de sous-produits, de solvant organique et de réactifs non réagis. Préparez la colonne de centrifugeuse avec 650 μL de gel P2 préhydraté en la faisant tourner à 18 000 x g pendant 1 min. Jeter le liquide d’écoulement et ajouter le mélange réactionnel. Tournez à nouveau à 18 000 x g pendant 1 min et récupérez le débit. Porter le mélange réactionnel à un volume final de 300 μL avec de l’eau ultrapure.REMARQUE: Pré-hydrater le gel P2 avec de l’eau pendant 6 h. Purifier le mélange réactionnel dessalé par CLHP en phase inverse. Les solvants organiques utilisés pour cette purification comprennent 0,1 M TEAA enH2O(solvant A) et 100% MeCN (solvant B, ou phase mobile). Avant d’injecter le mélange, équilibrer la colonne avec une condition initiale de 10% de solvant B avec un gradient de 1% / min. Réglez le débit à 1 mL/min. Injecter le mélange réactionnel dans la boucle HPLC avec une aiguille d’injection de 500 μL. Collectez le produit en visualisant l’absorption maximale à 260 nm pour l’ADN et à 560 nm pour le quencher BHQ2. Sécher le produit élué pendant la nuit dans un concentrateur centrifuge sous vide. Utiliser la substitution nucléophile pour coupler le brin inférieur TGT à l’ester Cy3B-NHS comme décrit dans Ma et. al25. Mélanger 100 μM du brin inférieur TGT de 56 pN (5Biosg/TTTTTT/iUniAmM/CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT) avec 50 μg d’ester Cy3B-NHS pré-dissous dans 10 μL de DMSO. Ajuster le pH de ce mélange à 9 avec 0,1 M de bicarbonate de sodium et porter le volume final à 100 μL avec 1x PBS. Incuber le mélange réactionnel pendant la nuit à RT. Purifier le mélange séquentiellement à l’aide de la filtration sur gel P2 et de la CLHP en phase inverse pour séparer les réactifs, les sels et les solvants organiques qui n’ont pas réagi (décrits aux étapes 1.4 et 1.5). Estimer la concentration des conjugués oligonucléotides-colorants purifiés en enregistrant leur absorbance à 260 nm à l’aide d’un spectrophotomètre. Caractériser les produits purifiés par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Dissoudre l’excès d’acide 3-hydroxypicolinique dans le solvant TA50 (acétonitrile à 50:50 v/v et TFA à 0,1 % dans ddH2O) pour préparer la matrice MALDI fraîche. Les masses moléculaires estimées et mesurées pour les produits étiquetés sont les suivantes : cRGDfK-1-BHQ2 – 8157,9 (calculé), 8160,1 (trouvé); Cy3B étiqueté 56 pN TGT – 10272.7 (calculé), 10295.8 (trouvé). Dissoudre les brins supérieur et inférieur séparément dans de l’eau sans nucléase à une concentration comprise entre 30 et 50 μM. Utilisez des embouts de pipette sans DNase pour éviter la contamination du stock. Conserver à 4 °C pour les applications à court terme ou à -20 °C pour les applications à long terme. La stabilité des oligonucléotides n’est pas affectée par les cycles répétés de gel-dégel. 2. Préparation de surface Jour 1 : Placez des couvercles en verre de 25 mm (jusqu’à 8) dans un rack en polytétrafluoroéthylène. Placer le rack dans un bécher borosilicate de 50 mL contenant 40 mL d’éthanol 200. Couvrir le bécher avec un film de paraffine pour éviter l’entrée d’eau et soniquer à une fréquence de fonctionnement de 35 kHz pendant 10-15 min à RT (Figure 1A). Remplir un bécher de 50 mL avec 40 mL de solution de piranha fraîchement préparée en mélangeant de l’acide sulfurique et du peroxyde d’hydrogène dans un rapport de 3:1 dans un bécher en pyrex. Remuer avec une pipette en verre. Transférer le porte-couvercle dans le bécher et incuber pendant 30 min à RT dans la hotte pour graver la surface du couvercle (Figure 1B).REMARQUE: Portez un EPI complet, y compris un manteau de laboratoire, des gants et des lunettes, et travaillez dans la hotte de fumée chimique. Ajouter lentement le peroxyde d’hydrogène à l’acide pour éviter la surchauffe de la solution. Après la gravure, utilisez une pince à épiler pour transférer le porte-couvercle dans un bécher avec de l’eau ultrapure. Répétez cette étape six fois à des intervalles de 15 s pour neutraliser complètement l’acide (Figure 1C).REMARQUE: Laissez la solution de piranha dans la hotte chimique pendant la nuit avant de la jeter dans le conteneur à déchets acides. Inspectez visuellement les couvercles pour vous assurer que les surfaces ont l’air propres sans motifs ni particules de poussière sur la surface du verre. Répétez les étapes 2.1 à 2.4 si des motifs ou de la poussière sont détectés.REMARQUE: Tester l’hydrophilie de la surface en trempant les couvercles traités dans l’eau et en les retirant verticalement. L’eau sur les couvertures traitées se retire sous forme de feuille uniforme pour former les anneaux de Young par rapport aux plaques de couverture non traitées qui forment des plaques. Transférer le porte-couvercle dans un bécher avec de l’éthanol résistant à 200 et laver deux fois pendant 15 s pour équilibrer les surfaces en solvant organique. Transférer le porte-couvercle dans une solution d’éthanol à 200 épreuves avec 3 % d’APTES pendant 1 h à RT pour silaniser les couvercles (Figure 1D). Couvrir le bécher avec un film de paraffine.REMARQUE: Les paramètres de dépôt APTES varient en fonction de la méthode de nettoyage de surface, de la teneur en eau du solvant, de la concentration APTES, des temps d’incubation et de la température de recuit. Immergez le rack dans un bécher propre avec une solution d’éthanol à l’épreuve des 200. Répétez ce lavage trois fois pendant 15 s chacun (Figure 1E). Sécher les couvercles à l’aide d’azote (N2) gazeux à faible pression de sortie. Placez les couvercles dans un plat en polystyrène de 10 cm avec un morceau de film de paraffine posé à plat à l’intérieur. Assurez-vous que les couvercles sont secs et séparés (Figure 1F). Ajouter 100 μL de solution de 2 mg/mL de NHS-biotine dans du DMSO à quatre couvercles placés sur un film de paraffine. Placer un « sandwich » avec les quatre autres couvercles sur le dessus (deux couvercles se faisant face avec la solution de fonctionnalisation entre les deux) et incuber le plat pendant la nuit à 4 °C (Figure 1G).REMARQUE: À 4 ° C, le réactif NHS est plus stable, ce qui facilite la fonctionnalisation uniforme de la surface. De plus, le sandwich conserve les réactifs. Évitez d’ajouter un excès de solution dans le sandwich, car il pourrait s’échapper et faire glisser les couvercles. Jour 2: Retirer le plat de 4 °C et séparer les couvercles en sandwich. Orientez les glissières dans le rack avec la surface revêtue l’une vers l’autre comme illustré à la figure 2A. Lavez-les avec une solution d’éthanol à l’épreuve de 200 trois fois pendant 15 s chacun. Sécher avec du gazN2 et les placer dans un nouveau plat avec un film de paraffine à l’intérieur.REMARQUE: L’orientation des couvercles comme indiqué permet d’identifier la surface fonctionnalisée. Lavez les couvercles avec 1 mL de 1x PBS trois fois pour les équilibrer à la phase aqueuse. Ajouter 800 μL d’albumine sérique bovine (BSA) à 0,1 % dans 1x PBS (p/v) à chacune des lames de couverture et incuber à RT pendant 30 min pour passer la surface et bloquer la liaison non spécifique des réactifs de fonctionnalisation ultérieurs (Figure 2B). Après l’incubation, laver les couvercles trois fois avec 1 mL de 1x PBS. Ajouter 800 μL de 1 μg/mL de streptavidine dans 1x PBS à RT pendant 45 à 60 min pour fonctionnaliser les couvercles (Figure 2C).REMARQUE: Conservez un couvercle sans streptavidine pour vérifier l’efficacité de la passivation (facultatif). Ajouter 10 nM de molécules biotinylées et image en utilisant des conditions expérimentales. Cette intensité de surface doit être proche du bruit sombre de la caméra. Simultanément à l’étape 2.11, assemblez les sondes TGT (haut : brin inférieur au rapport molaire 1:1) à une concentration finale de 50 nM dans 100 μL de 1 M NaCl dans un tube PCR à l’aide d’un thermocycleur. Dissocier les brins à 95 °C pendant 5 min, et recuit progressivement en réduisant la température à 25 °C et en la maintenant pendant 25 min (Figure 2D). Évitez l’exposition prolongée des sondes TGT à la lumière. Après l’incubation de la streptavidine, utilisez 1x PBS pour laver les couvercles trois fois. Ajouter 100 μL des sondes TGT pré-assemblées à quatre des couvercles et faire des sandwichs en utilisant les 4 couvercles restants avec le côté fonctionnalisé faisant face aux sondes (huit surfaces nécessitent quatre tubes de sondes TGT hybridées). Couvrir avec du papier d’aluminium et incuber pendant 1 h à RT pour permettre à la sonde de se lier à la surface (Figure 2E). Après l’incubation, séparez les sandwichs et lavez les couvercles avec 1x PBS trois fois. Les surfaces TGT sont maintenant prêtes pour l’imagerie. Assemblez soigneusement les couvercles dans des chambres d’imagerie prénettoyées et ajoutez 1x PBS pour garder les surfaces hydratées (Figure 2F).REMARQUE: Un assèchement excessif des chambres fissurera la surface. Empêcher le séchage des surfaces. 3. Préparation des cellules et coloration Pour étudier l’effet de la stimulation du facteur de croissance épidermique (EGF) sur la mécanique du Cos-7, l’adhésion et la propagation cellulaire, trypsiniser les cellules Cos-7 avec 0,05% de trypsine-EDTA pendant 2 min. Neutraliser la trypsine en la lavant avec HBSS et en centrifugant à 800 x g pendant 5 min. Répétez l’étape de neutralisation une fois de plus. Cellules de plaque à une densité de 4 x 104 cellules sur les surfaces TGT assemblées dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 50 ng / mL EGF ou DMEM sans EGF. Laisser les cellules se propager pendant 60 min à 37 °C avec 5 % de CO2 dans un incubateur de culture cellulaire (Figure 3A).REMARQUE: Les cellules sont incubées dans le DMEM sans sérum pour éviter la stimulation des facteurs de croissance. L’EGF est dilué dans 10 mM d’acide acétique pour obtenir un stock de 1 mg/mL. Il est utilisé à 50 ng/mL dans le DMEM pour les expériences d’imagerie. Après l’incubation, laver les cellules trois fois avec 1x PBS et fixer avec 2 mL de paraformaldéhyde à 4 % pendant 12 min à TA (Figure 3B).REMARQUE: Toutes les étapes d’incubation sont effectuées sur un agitateur rotatif à ~ 35 tr / min pour une propagation uniforme des solutions. Protégez les surfaces TGT de la lumière en les recouvrant jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’imagerie. Aspirer le fixateur et laver les couvercles cinq fois avec 1x PBS à des intervalles de 5 minutes à RT. Éventuellement, incuber les couvercles avec 50 mM NH4Cl dans 1x PBS pendant 30 min à 37 °C pour éteindre l’autofluorescence associée au paraformaldéhyde et laver trois fois avec 1x PBS à des intervalles de 5 min (Figure 3B). Ajouter le tampon A (1x PBS, 5% de sérum de cheval normal, 5% de sérum de chèvre normal, 1% de BSA, 0,025% de Triton X-100) et incuber pendant 30 min à 37 °C pour bloquer et perméabiliser les cellules. Lavez trois fois avec 1x PBS à des intervalles de 5 minutes (Figure 3B). Placez les chambres d’imagerie avec des couvercles dans un récipient d’humidité. Diluer l’anticorps anti-paxilline primaire (marqueur d’adhérence focale) à 1:250 dans un tampon bloquant (1x PBS, 5% de sérum de cheval normal, 5% de sérum de chèvre normal, 1% de BSA, 0,005% de Triton x-100). Incuber avec 200 μL de solution d’anticorps primaires par couvercle pendant 2 h à 37 °C (figure 3B).REMARQUE: Ne laissez pas les surfaces sécher. Lavez les couvercles cinq fois avec 1x PBS à des intervalles de 5 minutes et retournez-les dans le récipient d’humidité. Étiqueter les cellules simultanément avec un mélange d’anticorps secondaire anti-lapin conjugué au colorant à une dilution de 1:800 et de phalloïdine conjuguée au colorant (actine) à une dilution de 1:400 dans 200 μL de tampon bloquant par couvercle. Incuber à 37 °C pendant 60 min (Figure 3B). Lavez les surfaces cinq fois avec 1x PBS à des intervalles de 5 minutes et stockez-les à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’imagerie (Figure 3B).REMARQUE: Échantillons d’image dans les 3 jours suivant la préparation de la surface pour éviter la dégradation du signal. 4. Acquisition d’images Utilisez un objectif 60x à immersion dans l’huile avec une ouverture numérique élevée (1,49) sur un microscope inversé avec une excitation TIRF 488, 561 et 647, une excitation RICM, un système de mise au point parfait et un appareil photo numérique. Ajoutez de l’huile à l’objectif, nettoyez le fond de la chambre d’échantillonnage et placez l’échantillon sur la scène. Concentrez-vous sur une cellule et engagez la concentration parfaite. Mettez le microscope en mode d’imagerie RICM avec excitation d’épifluorescence et un cube de filtre GFP avec le filtre d’émission retiré. Alignez le RICM en fermant et en centrant le diaphragme d’ouverture de l’épi-éclairage. Mettez le microscope en mode TIRF avec excitation laser et un cube de filtre TIRF à quatre passes. Concentrez le laser 488 nm sur un petit point au plafond de la pièce et augmentez l’angle d’incidence jusqu’à ce qu’il dépasse l’angle critique tout en surveillant la fluorescence sur la caméra en mode direct. Observez une forte réduction de la fluorescence de fond et un seul plan de mise au point lorsque l’angle critique est dépassé.REMARQUE: TIRF excite une région mince (~ 100 nm) la plus proche de l’interface de glissement d’échantillon mettant en évidence les sondes TGT ouvertes et les adhérences focales tout en éliminant la fluorescence floue de l’intérieur de la cellule. Si le TIRF n’est pas disponible, l’épifluorescence peut être utilisée; cependant, les rapports signal/bruit seront plus faibles. Identifiez les cellules pour l’imagerie à l’aide du mode « live » de la caméra à l’aide de RICM. Acquérir l’image RICM et les images TIRF de l’actine (640 nm ex), de la tension de l’intégrine (561 nm ex) et de la paxilline (488 nm ex). Obtenez des images séquentiellement en utilisant un temps d’exposition de 200 ms.REMARQUE: Le temps d’exposition dépend de nombreux facteurs, notamment l’objectif, la puissance du laser, les filtres d’émission et la sensibilité de l’appareil photo. Le signal doit être au moins 2 fois supérieur à l’arrière-plan. L’arrière-plan est d’environ 1000 UA, de sorte que le signal doit être d’au moins 2000-3000 UA. Répétez 4.4-4.5 pour au moins 30 cellules. Modifiez les capots, faites la mise au point et répétez 4.4-4.5. 5. Analyse des données REMARQUE: Effectuer une analyse quantitative d’images à l’aide du logiciel Fidji et l’analyse à l’aide d’un logiciel de statistiques. Ouvrez le jeu d’images pour une cellule. Créez un masque de la zone de cellule (masque RICM) en traçant la limite de la cellule dans l’image RICM à l’aide de l’outil de sélection ImageJ Freehand. Enregistrez la région d’intérêt (ROI) dans le gestionnaire de retour sur investissement (Outils d’analyse > > gestionnaire de retour sur investissement) (Figure 4A1,2). Choisissez une zone représentative à l’extérieur de la cellule dans l’image de tension d’intégrine et dessinez un retour sur investissement d’au moins 200 x 200 pixels. Exclure toute autre cellule ou débris fluorescent du retour sur investissement. Mesurez la fluorescence de fond dans le retour sur investissement à l’aide de l’outil de mesure (Analyser > Mesure) (Figure 4A3). Soustrayez la fluorescence de fond moyenne obtenue à l’étape 5.2 de l’image de tension (Process > Math > Subtract) (Figure 4A4). Utilisez le masque RICM établi à l’étape 5.2 pour définir le signal de tension à l’intérieur de l’empreinte de la cellule (gestionnaire de retour sur investissement > Sélectionner > Appliquer le masque > Modifier > Effacer à l’extérieur) (Figure 4A5). Créez un masque de seuil pour l’image de tension à l’aide de la méthode de Huang pour le seuil automatique (Image > Ajuster > Seuil) (Figure 4A6). Assurez-vous que le masque de seuil représente le mieux la zone de tension d’intégrine générée. En règle générale, définissez le seuil sur 2x la fluorescence de fond moyenne. Créez une sélection du masque de tension seuillé (Modifier > Sélection > Créer) (Figure 4A7). Transférez le masque sélectionné sur l’image de tension générée à l’étape 5.4 et mesurez l’intensité intégrée des sondes ouvertes (gestionnaire de retour sur investissement > Select (masque de tension) > Analyser > Mesure > RawIntDen) (Figure 4C). Mesurez la zone des propriétés morphométriques de la cellule, la circularité et le rapport L/H à partir du masque RICM (gestionnaire de retour sur investissement > Sélectionner (masque RICM) > Appliquer le masque > Analyser > mesure) (Figure 4B). Mesurez la densité de rupture mécanique, définie comme le pourcentage de l’empreinte de la cellule avec les sondes rompues en sélectionnant l’image du masque de tension et en appliquant le masque RICM (roi manager > Select (RICM Mask) > Analyze > Measure > %Area) (Figure 4C). Exportez les mesures pour une analyse et une visualisation plus approfondies dans un logiciel de statistiques. Répétez 5.1-5.11 pour chaque cellule.