مجسات حبل مقياس التوتر لقياس ميكانيكا إنجرين بوساطة عامل النمو والتصاق
Summary
سطح TGT هو منصة مبتكرة لدراسة عامل النمو – integrin عبر الحديث. يسمح تصميم المسبار المرن وخصوصية رباط الالتصاق والتشكيل الدقيق لظروف التحفيز بإجراء تقييمات كمية قوية للتفاعل بين EGFR-integrin. تسلط النتائج الضوء على EGFR باعتباره “منظما ميكانيكيا” لضبط ميكانيكا الإنجرين ، مما يؤثر على تجميع الالتصاق البؤري وانتشار الخلايا.
Abstract
تعتمد الكائنات الحية متعددة الخلايا على التفاعلات بين مستقبلات الغشاء والأربطة المتشابهة في المصفوفة خارج الخلية المحيطة (ECM) لتنسيق وظائف متعددة ، بما في ذلك الالتصاق والانتشار والهجرة والتمايز. يمكن أن تنتقل القوى الميكانيكية من الخلية عبر مستقبل الالتصاق integrin إلى الأربطة في ECM. يمكن تعديل كمية هذه القوى المتولدة عن الخلايا وتنظيمها المكاني بواسطة مستقبلات عامل النمو ، بما في ذلك مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR). الأدوات المتاحة حاليا لقياس التغيرات بوساطة المحادثة المتقاطعة في ميكانيكا الخلايا وربطها بالالتصاقات البؤرية والمورفولوجيا الخلوية والإشارات محدودة. تم استخدام مستشعرات القوة الجزيئية القائمة على الحمض النووي والمعروفة باسم حبال مقياس التوتر (TGTs) لتحديد هذه التغييرات. تعتبر مجسات TGT فريدة من نوعها في قدرتها على تعديل عتبة القوة الأساسية والإبلاغ عن قوى مستقبلات مقياس بيكونوتون عبر سطح الخلية الملتصقة بالكامل بدقة مكانية محدودة الحيود . تعتمد مجسات TGT المستخدمة هنا على التفكك الذي لا رجعة فيه لدوبلكس الحمض النووي بواسطة قوى مستقبلات الروابط التي تولد إشارة فلورسنت. هذا يسمح بالقياس الكمي لتوتر الإنتغرين التراكمي (تاريخ القوة) للخلية. توضح هذه المقالة بروتوكولا يستخدم TGTs لدراسة تأثير EGFR على ميكانيكا الإنتغرين وتشكيل الالتصاق. يتم تفصيل تجميع منصة الاستشعار الميكانيكية TGT بشكل منهجي ويتم تحديد الإجراء الخاص بقوى الصورة والالتصاقات البؤرية وانتشار الخلايا. بشكل عام ، فإن القدرة على تعديل عتبة القوة الأساسية للمسبار ، ورباط الالتصاق ، ونوع وتركيز عامل النمو المستخدم في التحفيز تجعل من هذا منصة قوية لدراسة تفاعل مستقبلات الغشاء المتنوعة في تنظيم القوى بوساطة التكامل.
Introduction
تتمتع الخلايا بالقدرة الجوهرية على استشعار القوى الميكانيكية وتوليدها والاستجابة لها ، مما يؤدي إلى تغييرات في النمط الظاهري الخلوي وإعادة تشكيل البيئة الدقيقة المحلية 1,2. تلعب القوى دورا حاسما في تنظيم العديد من جوانب سلوك الخلايا ، بما في ذلك الالتصاق والهجرة والانتشار والتمايز والتئام الجروح 3,4. يمكن أن تؤدي الانحرافات في التبادل الميكانيكي ثنائي الاتجاه بين الخلية والبيئة الدقيقة إلى حالات مرضية ، بما في ذلك السرطان5. تشارك العديد من مستقبلات الغشاء في الحفاظ على توازن مصفوفة الخلايا. من هذه ، فإن الإنتينجينات ومستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) لها تآزر قوي 6,7. تقليديا ، تنشئ integrins الرابط الميكانيكي بين البيئة الدقيقة والهيكل الخلوي داخل الخلايا بينما ينظم EGFR نمو الخلايا وانتشارها وبقائها على قيد الحياة 8,9. EGFR هو هدف علاجي مدروس للغاية ، يركز على التنظيم الخارجي لتسهيل الإشارات داخل الخلايا. تم إنشاء EGFR-integrin crosstalk وراثيا وكيميائيا حيويا لتنظيم تطور أمراض متعددة ، بما في ذلك السرطان10,11. في حين تشير الدراسات إلى وجود تفاعل EGFR-integrin ، تعزى النتائج إلى مسارات الإشارات بعيدا عن غشاء البلازما7،12،13،14. لا يزال تأثير EGFR ، أو عوامل النمو الأخرى ، على ميكانيكا الخلايا غير مستكشف إلى حد كبير ويرجع ذلك جزئيا إلى نقص الأدوات اللازمة لقياس القوى الخلوية ونتائج الإشارات. يكمن التحدي في تحديد الأدوات المناسبة لدراسة الاتصال بين نماذج الإشارات المتوازية هذه وتحديد مساهماتها المحددة في ميكانيكا الخلايا.
تم تطوير العديد من الأساليب لقياس القوى الناتجة عن مستقبلات التصاق الخلايا ، ويتم توجيه القارئ إلى مراجعات متعمقة لهذه التقنيات15,16. باختصار ، يعتمد الفحص المجهري لقوة الجر والكشف عن صفيف الأعمدة الدقيقة على تشوه الركيزة الأساسية لاستنتاج قوى نانونيوتن (nN) ، وهو ترتيب من حيث الحجم أكثر من قوى المستقبلات الفردية17,18. تقنيات الجزيء الواحد ، بما في ذلك AFM والملقط البصري ، حساسة لقوى البيكونوتون البروتين الواحد (pN) ولكنها تقيس مستقبلا واحدا فقط في كل مرة ولا تقدم دقة مكانية جيدة (أو أي). توفر مجسات التوتر الجزيئي القائمة على الحمض النووي ومجسات حبل مقياس التوتر (TGT) دقة قوة pN بدقة مكانية محدودة الحيود (أو أفضل) ، مما يمنحها دورا فريدا في دراسة قوى الخلية الواحدة19,20 من أنواع الخلايا المتنوعة ، بما في ذلك الخلايا الليفية والخلايا السرطانية والصفائح الدموية والخلايا المناعية21,22,23,24 . في حين أن مجسات التوتر الجزيئي تحتوي على عنصر “نابض” قابل للتمديد ، وهو مثالي للتصوير في الوقت الفعلي ، فإن تحقيقات TGT تتمزق بشكل لا رجعة فيه ، تاركة وراءها “تاريخ قوة” الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك ، تقوم TGTs بتعديل عتبة التوتر للركيزة الأساسية ؛ يمكن استخدام سلسلة من المجسات ذات التركيبات الكيميائية المماثلة ولكن قوى تمزق مختلفة ، أو تحمل التوتر (Ttol) ، لتحديد الحد الأدنى من التوتر المطلوب لتشكيل الالتصاق البؤري وانتشار الخلايا. تتكون مجسات TGT من شريطين متكاملين للحمض النووي ، أحدهما مثبت على السطح والآخر يقدم رابطا للخلية. إذا ربط مستقبل الرباط ومارس قوة أكبر من Ttol للمسبار ، فصل الخيوط. يتم تعريف Ttol على أنه القوة الثابتة اللازمة لتمزيق 50٪ من المجسات في فترة 2 ثانية في ظل ظروف مثالية. في تحقيقات TGT “الدورانية” ، يمكن فصل المبرد الموجود على الشريط العلوي عن الفلوروفور الموجود على الخيط السفلي. فقط عندما تمزق مسبار TGT ، على الأرجح بواسطة قوى أكبر من أو تساوي Ttol ، سيتم إنشاء إشارة فلورسنت. يمكن أيضا إصلاح مجسات TGT ، مما يسمح بسهولة التلاعب بالأنظمة البيولوجية واختبار ظروف متعددة. لهذه الأسباب ، تم استخدام تحقيقات TGT في هذا العمل.
تم استخدام مجسات TGT لدراسة كيفية تعديل التصاق الخلايا المعتمدة على التكامل والقوى الميكانيكية بواسطة EGFR21 المنشط. أسس هذا العمل EGFR ك “منظم ميكانيكي” ، وضبط منظمة الالتصاق البؤري وتوليد التوتر. بالإضافة إلى ذلك ، وجد أن تحفيز EGF أثر على توزيع ونضج الالتصاقات البؤرية وتعزيز انتشار الخلايا. يمكن استخدام هذا النهج في الدراسات المستقبلية للتحقيق في كيفية تأثير عوامل النمو على القوى الميكانيكية في تطور الورم وديناميكياته. في حين تم تأسيس دور EGFR-integrin crosstalk في تنظيم الانتقال الظهاري إلى الوسيط ، فإن دور القوى الميكانيكية في هذه العملية لا يزال غير مستكشف10.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لهذه التجارب يغطي توليف وتجميع 56 مسبارا من pN TGT ، وتوليد أسطح TGT على أغطية زجاجية ، وتطبيق خلايا Cos-7 على سطح TGT والتحفيز باستخدام EGF ، والتثبيت ، وتلطيخ الخلايا بالفيلويدين ، والجسم المضاد المضاد للباكسيلين ، وتألق الانعكاس الداخلي الكلي عالي الدقة (TIRF) والتصوير المجهري لتباين تداخل الانعكاس (RICM) ، وقياس كمية الصورة. هذا البروتوكول ، على الرغم من أنه مكتوب للتحقيق في تحفيز EGF لخلايا Cos-7 ، إلا أنه قابل للتكيف بسهولة مع العديد من التجارب القائمة على TGT. يمكن استبدال الأربطة المختلفة ، و Ttol ، وأنواع الخلايا ، ومعلمات التحفيز ، والبروتينات التي تحمل علامة التثبيت التالية ، والتحليل الكمي بسهولة ، مما يجعل هذا البروتوكول قويا ومفيدا على نطاق واسع.
Protocol
Representative Results
Discussion
من خلال الإجراء التفصيلي خطوة بخطوة الموضح أعلاه ، يمكن للمرء إعداد أسطح TGT لقياس مورفولوجيا الخلية وتوتر الإنتينجين الناتج عن الخلايا الملتصقة أثناء تعلق الخلية وانتشارها بعد العلاج باستخدام EGF. وفر تصميم المسبار المباشر وتوليفه وإعداده السطحي إلى جانب الإعداد التجريبي البسيط منصة مستقرة لدراسة تفاعل EGFR و integrins. بشكل عام ، تؤكد النتائج أن التنشيط المعتمد على الرباط ل EGFR يعزز انتشار الخلايا ، ويضبط الخصائص الحاملة للقوة لمستقبلات الإنتينجين ، ويعزز تنظيم الالتصاق البؤري والنضج. تدعم النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام مجسات TGT الفرضية الشاملة القائلة بأن عوامل النمو ، مثل EGFR ، تعمل ك “منظمي ميكانيكي” ، مما يزيد من كمية توتر الإنتينجين وتنظيمه المكاني وينظم اتجاه وميكانيكا الالتصاقات البؤرية.
عند التطبيق على سطح TGT ، تهبط الخلايا وتعلق وتنتشر مع استشعار مستقبلات الإنتينجين (αVβ3) وارتباطها برباط cRGDfK. وبذلك يمكن تمزيق مجسات TGT ميكانيكيا، مما يولد تألقا في موقع اشتباك الليغاند. القراءة هي “تاريخ القوة” التراكمي للخلية المتفاعلة مع السطح. هناك بعض المشكلات الشائعة في أسطح TGT التي يمكن أن تكون موجودة أثناء هذه التجارب. قد يكون التألق العالي في الخلفية السطحية (الشكل 6A ، B) ، والمظهر السطحي غير المكتمل ، وفشل الخلايا في توليد إشارة التوتر (الشكل 6C ، D) ، وفشل الخلايا في الانتشار (الشكل 6E ، F) بسبب أوجه القصور التقنية في مسبار TGT أو التوليف السطحي. وترد في الجدول 1 حلول لهذه المسائل المشتركة.
يوفر التصميم المباشر لمجسات TGT لعلماء الأحياء الخلوية أداة قوية لدراسة نتائج إشارات محددة لعامل النمو بمعزل عن غيرها دون تدخل من مستقبلات سطح الخلية الأخرى من خلال توفير روابط ومحفزات محددة فقط. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح تحقيقات TGT بالتحقيق في عتبة التوتر التي تؤكد على مستقبلات الإنتغرين الفردية أثناء التصاق الخلايا عند حساسية pN. تفشل النهج البديلة في الإبلاغ عن القوى التي تمارسها المستقبلات الفردية ذات الدقة المكانية العالية في العينات الثابتة31. الفحص المجهري لقوة الجر حساس فقط لقوى nN ، وهو ترتيب من حيث الحجم أعلى من القوى التي تطبقها مستقبلات integrin الفردية15 ، وتقوم مجسات التوتر الجزيئي بقياس قوى pN ، ولكن لأنها قابلة للانعكاس ، فإنها لا تتحمل التثبيت بقوة. لهذه الأسباب ، تعد مجسات TGT أداة جذابة لدراسة آليات تفاعلات عامل النمو و integrin.
هناك العديد من الفروق الدقيقة التقنية المرتبطة بتحقيقات TGT التي يجب مراعاتها قبل تصميم التجربة. صورة التوتر هي لقطة في الوقت المناسب ، تمثل تاريخ القوة وليست مؤشرا على اشتباكات مستقبلات الرباط في أي وقت من الأوقات. نظرا لأن توليد الإشارة يعتمد على فصل المسبار ، فإن التألق TGT ينتج عن مجسات مفتوحة لا تتعرض للتوتر النشط من تفاعل مستقبلات الرباط. وهذا يعني أن قراءة توتر الإنتينجين الذي تم الحصول عليه على سطح TGT تاريخية وتراكمية بطبيعتها تمثل المكان الذي كانت فيه قوى أكبر من Ttol. لم يتم الإبلاغ عن مواقع قوى رباط المستقبلات الحالية الأقل من Ttol 19,32. نظرا لأن تمزق TGT يؤدي إلى إنهاء ارتباط رباط المستقبلات ، فإن انتشار الخلايا يرجع إلى تفاعلات integrin-ligand التي تواجه قوى أقل من Ttol. لذلك يجب على المستخدم توخي الحذر عند تحديد وقت ما بعد الطلاء لتقدير النتائج الميكانيكية المرتبطة بالالتصاقات القائمة على التكامل. أخيرا ، يجب النظر في معنى Ttol. تحتوي مجسات TGT المستخدمة هنا على T tol من 56 pN ، حيث Ttol هي القوة الثابتة اللازمة لتمزيق 50٪ من المجسات عند تطبيقها على 2 s. عند النظر في الأنظمة البيولوجية المعقدة ، من المحتمل أن تواجه TGTs تدرجا غير متجانس ومتنوع للقوة مع تبعيات زمنية متفاوتة. إذا تم تمزيق TGTs بواسطة قوى أكبر من Ttol ، فإن التألق سيكون أقل من شأن التوتر الكلي. بدلا من ذلك ، يمكن للقوى الأقل من Ttol المطبقة لفترات أطول أن تمزق عددا مشابها من المسابير مثل قوى العتبة العالية المطبقة لأوقات أقصر. قد يؤدي كلا السيناريوهين إلى نفس قراءة شدة التألق ، مما يجعل من الصعب حل حجم التوتر الدقيق أو الديناميكيات باستخدام تحقيقات TGT33,34.
بشكل عام ، يجب إجراء تقييمات لتوتر الإنتينجين مع تحفيز عامل النمو بعناية من خلال تصميم تجارب مع الضوابط الداخلية ، ومقارنة ملامح الانتشار على الأسطح الأخرى المغلفة بالمصفوفة ، وإجراء تقييمات متوازية لتألق TGT في الخلايا في وجود أو عدم وجود تحفيز عامل النمو ، واستخدام TGTs مع مختلف Ttol . تسمح TGTs بتحديد حجم دور إشارات عامل النمو في تنظيم ميكانيكا مستقبلات الإنتغرين ، وديناميكيات الالتصاق البؤري ، وانتشار الخلايا. يمكن استخدام هذا البروتوكول كقالب للعديد من التجارب المستندة إلى TGT باستخدام مجساتذات تول T مختلفة أو روابط مختلفة أو أنواع خلايا مختلفة أو ظروف تحفيز مختلفة. يمكن تصنيف أي بروتينات ذات أهمية بعد التثبيت ، ويمكن تنفيذ أي نوع من التحليل الكمي للصور. على هذا النحو ، نقدم نموذجا للعديد من تجارب TGT.
لا يقتصر استخدام مجسات TGT على دراسة الإنتيجينز ولكن يمكن توسيعه إلى مجموعة متنوعة من مستقبلات غشاء الخلايا عبر أنواع مختلفة من الخلايا عن طريق تعديل الليكاند. تم استخدام مجسات TGT للتحقيق في دور القوى في تنظيم سلاسل إشارات المستقبلات المختلفة ، بما في ذلك تحديد الدور الميكانيكي لميكانيكا مستقبلات Notch في التطور الجنيني وتكوين الخلايا العصبية35 ، والقوى التي تتوسط في تحديد واستيعاب المستضدات بواسطة مستقبلات الخلايا البائية 36 ، والقدرة الميكانيكية على التدقيق اللغوي لمستقبلات سطح الخلايا التائية للكشف عن التغيرات في القوى لتعزيز قوة وخصوصية نقل الإشارة37 . معا ، تسلط هذه النتائج الضوء على الإمكانات الهائلة لتحقيقات TGT في مجموعة متنوعة من الإعدادات التجريبية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم لأعضاء مختبر Mattheyses للمناقشات والانتقادات المثمرة. نحن نقر بتمويل A.L.M. من NSF CAREER 1832100 و NIH R01GM131099.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Millipore Sigma | 440140 | Surface Preparation |
| 3-hydroxypicolinic acid (3-HPA) | Millipore Sigma | 56197 | Maldi-TOF-MS matrix |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | A38S | Diluting EGF |
| Acetonitrile (HPLC) | Fisher Scientific | A998SK | Oligonucleotide Preparation |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Cell Signaling Technology | 8878S | Immunocytochemistry |
| Ammonium Chloride | Fisher Scientific | A687 | Immunocytochemistry |
| Anti-Paxillin antibody [Y113] | Abcam | ab32084 | Immunocytochemistry |
| BD Syringes only with Luer-Lok | BD bioscience | 309657 | Surface Preparation |
| Bio-Gel P-2 | Bio-Rad | 1504118 | Oligonucleotide Preparation |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | Surface Preparation |
| Cos-7 cells | ATCC | CRL-1651 | Cell Culture, Passage numbers 11-20 |
| Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips | Fisher Scientific | C14784 | Surface Preparation |
| c(RGDfK(PEG-PEG)), PEG=8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid | Vivitide | PCI-3696-PI | Oligonucleotide Preparation |
| Cy3B NHS ester | GE Healthcare | PA63101 | Oligonucleotide Preparation |
| Dimethylformamide | Millipore Sigma | PHR1553 | Oligonucleotide Preparation |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Fisher Scientific | MT10013C | Cell Culture |
| Epidermal Growth Factor human EGF | Millipore Sigma | E9644 | Cell Culture |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22032601 | Surface Preparation |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08-772E | Surface Preparation |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10-438-026 | Cell Culture |
| Flurobrite DMEM | Fisher Scientific | A1896701 | Cell Culture |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21244 | Immunocytochemistry |
| Goat Serum | Fisher Scientific | 16-210-064 | Immunocytochemistry |
| Hank’s balanced salts (HBSS) | Fisher Scientific | 14-170-161 | Cell Culture |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 16050130 | Immunocytochemistry |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-500 | Surface Preparation |
| Nanosep MF centrifugal devices | Pall laboratory | ODM02C35 | Oligonucleotide Preparation |
| NHS-azide | Fisher Scientific | 88902 | Oligonucleotide Preparation |
| Nitrogen Gas Cylinder | Airgas | Surface Preparation | |
| No. 2 round glass coverslips – 25 mm | VWR | 48382-085 | Surface Preparation |
| Parafilm M Laboratory Film | Fisher Scientific | 13-374-10 | Surface Preparation |
| Paraformaldehyde 16% | Fisher Scientific | 50-980-487 | Immunocytochemistry |
| PBS, 1X | Fisher Scientific | 21-030-CV | Surface Preparation/Immunocytochemistry |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15-070-063 | Cell Culture |
| PYREX Low Form Griffin Beakers | Fisher Scientific | 02-540G | Surface Preparation |
| Sodium Ascorbate | Fisher Scientific | 18-606-310 | Oligonucleotide Preparation |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | Oligonucleotide Preparation |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | Surface Preparation |
| Streptavidin | Fisher Scientific | 434301 | Surface Preparation |
| Sulfo-NHS-LC-Biotin | Fisher Scientific | 21335 | Surface Preparation |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300-500 | Surface Preparation |
| TEAA | Fisher Scientific | NC0322726 | Oligonucleotide Preparation |
| Triethylamine | Millipore Sigma | 471283 | Oligonucleotide Preparation |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28901 | Oligonucleotide Preparation |
| THPTA | Fisher Scientific | NC1296293 | Oligonucleotide Preparation |
| Triton X 100 Detergent Surfact Ams Solution | Fisher Scientific | 85111 | Immunocytochemistry |
| Water, DNA Grade, DNASE, Protease free | Fisher Scientific | BP24701 | Oligonucleotide Preparation |
| Equipment | |||
| Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm | Agilent | 653950-702 | Oligonucleotide Preparation |
| High-performance liquid chromatography | Agilent | 1100 | Oligonucleotide Preparation |
| Low Speed Orbital Shaker | Fisher Scientific | 10-320-813 | Immunocytochemistry |
| Matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS) | Voyager STR | Oligonucleotide Preparation | |
| Molecular Probes Attofluor Cell Chamber | Fisher Scientific | A7816 | Surface Preparation |
| Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher | Oligonucleotide Preparation | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope | pe Nikon | Microscopy | |
| Nikon Perfect Focus System | Nikon | Microscopy | |
| NIS Elements software | Nikon | Microscopy | |
| ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera | Hamamatsu | Microscopy | |
| Quad band TIRF 405/488/561/647 cube | CHROMA | Microscopy | |
| RICM Cube | CHROMA | Microscopy | |
| SOLA v-nIR Light Engine | Lumencor | Microscopy | |
| Thermo Forma Steri Cycle 370 CO2 Incubator | Fisher Scientific | Cell Culture | |
| VWR 75D Ultrasonic Cleaner | VWR | 13710 | Surface Preparation |
| Data Analysis | Use | ||
| Fiji (Image J) | https://imagej.net/software/fiji/downloads | Quantitative Analysis | |
| Graph Pad Prism | Graph Pad | Statistical Analysis | |
| Oligo name | 5'modification/ 3' modification | Sequence (5' to 3') | Use |
| Alkyne-21-BHQ2 | 5' Hexynyl/ 3' BHQ_2 | GTGAAATACCGCACAGATGCG | Top strand TGT probe |
| 56 pN TGT | 5' Biosg/TTTTTT/iUniAmM | CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT | Bottom strand TGT probe |
| 12 pN TGT | 5' AmMC6/ 3' BioTEG | CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT | Bottom strand TGT probe |
References
- Lim, C. -. G., Jang, J., Kim, C. Cellular machinery for sensing mechanical force. BMB Reports. 51 (12), 623-629 (2018).
- Moraes, C., Sun, Y., Simmons, C. A. (Micro)managing the mechanical microenvironment. Integrative Biology. 3 (10), 959-971 (2011).
- Vogel, V., Sheetz, M. P. Mechanical forces matter in health and disease. From Cancer to Tissue Engineering. Nanotechnology. , 233-303 (2010).
- Wang, J. H. C., Li, B. Mechanics rules cell biology. BMC Sports Science, Medicine and Rehabilitation. 2 (1), 16 (2010).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
- Streuli, C. H., Akhtar, N. Signal co-operation between integrins and other receptor systems. Biochemical Journal. 418 (3), 491-506 (2009).
- Chiasson-MacKenzie, C., McClatchey, A. I. EGFR-induced cytoskeletal changes drive complex cell behaviors: The tip of the iceberg. Science Signaling. 11 (515), (2018).
- Kechagia, J. Z., Ivaska, J., Roca-Cusachs, P. Integrins as biomechanical sensors of the microenvironment. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 457-473 (2019).
- De Luca, A., et al. The role of the EGFR signaling in tumor microenvironment. Journal of Cellular Physiology. 214 (3), 559-567 (2008).
- Javadi, S., Zhiani, M., Mousavi, M. A., Fathi, M. Crosstalk between Epidermal Growth Factor Receptors (EGFR) and integrins in resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in solid tumors. European Journal of Cell Biology. 99 (4), 151083 (2020).
- Eliceiri, B. P. Integrin and growth factor receptor crosstalk. Circulation Research. 89 (12), 1104-1110 (2001).
- Dan, L., Jian, D., Na, L., Xiaozhong, W. Crosstalk between EGFR and integrin affects invasion and proliferation of gastric cancer cell line, SGC7901. OncoTargets and Therapy. 5, 271-277 (2012).
- Giancotti, F. G., Tarone, G. Positional control of cell fate through joint integrin/receptor protein kinase signaling. Annual Reviews: Cell and Developmental Biology. 19, 173-206 (2003).
- Ricono, J. M., et al. Specific cross-talk between epidermal growth factor receptor and integrin alphavbeta5 promotes carcinoma cell invasion and metastasis. Cancer Research. 69 (4), 1383-1391 (2009).
- Polacheck, W. J., Chen, C. S. Measuring cell-generated forces: a guide to the available tools. Nature Methods. 13 (5), 415-423 (2016).
- Hang, X., et al. Nanosensors for single cell mechanical interrogation. Biosensors and Bioelectronics. 179, 113086 (2021).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. Probing cellular traction forces by micropillar arrays: contribution of substrate warping to pillar deflection. Nano Letters. 10 (5), 1823-1830 (2010).
- Ma, V. P. -. Y., Salaita, K. DNA Nanotechnology as an Emerging Tool to Study Mechanotransduction in Living Systems. Small. 15 (26), 1900961 (2019).
- Kim, Y., Kim, K. A., Kim, B. C. Double-stranded DNA force sensors to study the molecular level forces required to activate signaling pathways. Journal of the Korean Physical Society. 78 (5), 386-392 (2021).
- Rao, T. C., et al. EGFR activation attenuates the mechanical threshold for integrin tension and focal adhesion formation. Journal of Cell Sciences. 133 (13), (2020).
- Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
- Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
- Zhang, Y., et al. Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 325-330 (2018).
- Ma, V. P. -. Y., et al. Mechanically induced catalytic amplification reaction for readout of receptor-mediated cellular forces. Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5488-5492 (2016).
- Wang, X., Ha, T. Defining single molecular forces required to activate integrin and notch signaling. Science. 340 (6135), 991-994 (2013).
- Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60-61, 70-85 (2017).
- Kantlehner, M., et al. Surface coating with cyclic RGD peptides stimulates osteoblast adhesion and proliferation as well as bone formation. ChemBioChem. 1 (2), 107-114 (2000).
- Kapp, T. G., et al. A comprehensive evaluation of the activity and selectivity profile of ligands for RGD-binding integrins. Scientific Reports. 7, 39805 (2017).
- Kok, R. J., et al. Preparation and functional evaluation of RGD-modified proteins as alpha(v)beta(3) integrin directed therapeutics. Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 128-135 (2002).
- Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
- Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
- Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
- Yasunaga, A., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2019).
- Luca, V. C., et al. Notch-Jagged complex structure implicates a catch bond in tuning ligand sensitivity. Science. 355 (6331), 1320-1324 (2017).
- Spillane, K. M., Tolar, P. B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).
- Brockman, J. M., Salaita, K. Mechanical proofreading: a general mechanism to enhance the fidelity of information transfer between cells. Frontiers in Physics. 7, 14 (2019).
