Расшифровка молекулярного механизма сборки гистонов методом ДНК-занавеса
Summary
ДНК-занавес, высокопроизводительный метод визуализации одной молекулы, обеспечивает платформу для визуализации различных взаимодействий белка и ДНК в режиме реального времени. В настоящем протоколе используется метод ДНК-занавеса для исследования биологической роли и молекулярного механизма Abo1, бромдомен-содержащей ААА+ АТФазы Schizosaccharomyces pombe .
Abstract
Хроматин представляет собой структуру высшего порядка, которая упаковывает эукариотическую ДНК. Хроматин претерпевает динамические изменения в зависимости от фазы клеточного цикла и в ответ на стимулы окружающей среды. Эти изменения необходимы для целостности генома, эпигенетической регуляции и метаболических реакций ДНК, таких как репликация, транскрипция и репарация. Сборка хроматина имеет решающее значение для динамики хроматина и катализируется шаперонами гистонов. Несмотря на обширные исследования, механизмы, с помощью которых шапероны гистонов обеспечивают сборку хроматина, остаются неуловимыми. Более того, глобальные особенности нуклеосом, организованных шаперонами гистонов, плохо изучены. Для решения этих проблем в данной работе описывается уникальный метод визуализации одной молекулы, называемый ДНК-занавесом, который облегчает исследование молекулярных деталей сборки нуклеосом с помощью гистонов-шаперонов. ДНК-занавес — это гибридный метод, который сочетает в себе липидную текучесть, микрофлюидику и флуоресцентную микроскопию с полным внутренним отражением (TIRFM), чтобы обеспечить универсальную платформу для визуализации различных взаимодействий белка и ДНК в режиме реального времени. С помощью ДНК-занавеса исследована функция гистонов-шаперонов Abo1, бромдомен-содержащая ААА+-АТФазу Schizosaccharomyces pombe , а также выявлен молекулярный механизм, лежащий в основе сборки гистонов Abo1. ДНК-занавес обеспечивает уникальный подход к изучению динамики хроматина.
Introduction
Эукариотическая ДНК упакована в структуру более высокого порядка, известную как хроматин 1,2. Нуклеосома является фундаментальной единицей хроматина, которая состоит примерно из 147.н. ДНК, обернутой вокруг гистонов октамерного ядра 3,4. Хроматин играет важнейшую роль в эукариотических клетках; например, компактная структура защищает ДНК от эндогенных факторов и экзогенных угроз5. Структура хроматина динамически изменяется в зависимости от фазы клеточного цикла и стимулов окружающей среды, и эти изменения контролируют доступ к белкам во время транзакций ДНК, таких как репликация, транскрипцияи репарация. Динамика хроматина также важна для стабильности генома и эпигенетической информации.
Хроматин динамически регулируется различными факторами, включая модификации гистонового хвоста и организаторы хроматина, такие как ремоделировщики хроматина, белки поликомбной группы и шапероны гистонов7. Шапероны гистонов координируют сборку и разборку нуклеосом путем осаждения или отрыва основных гистонов 8,9. Дефекты в шаперонах гистонов индуцируют нестабильность генома и вызывают нарушения развития и рак 9,10. Различные шапероны гистонов не нуждаются в химическом потреблении энергии, таком как гидролиз АТФ, для сборки или разборки нуклеосом 9,11,12,13. Недавно исследователи сообщили, что бромдоменсодержащие ААА+ (АТФаза, связанная с разнообразной клеточной активностью) АТФазы играют роль в динамике хроматина в качестве гистонов-шаперонов 14,15,16,17. Человеческий ATAD2 (АТФазный ААА-содержащий белок 2) способствует доступности хроматина для усиления экспрессии генов18. В качестве транскрипционного корегулятора ATAD2 регулирует хроматин онкогенных транскрипционных факторов14, а гиперэкспрессия ATAD2 связана с плохим прогнозом при многих типах рака19. Yta7, гомолог ATAD2 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), снижает плотность нуклеосом в хроматине15. Напротив, Abo1, гомолог ATAD2 Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), увеличивает плотность нуклеосом16. Используя уникальный метод визуализации одной молекулы, ДНК-занавеса, решается, способствует ли Abo1 сборке или разборке нуклеосом17,20.
Традиционно биохимические свойства биомолекул изучались с помощью массовых экспериментов, таких как электрофоретический анализ сдвига подвижности (EMSA) или коиммунопреципитация (co-IP), в которых исследуется большое количество молекул и характеризуются их средние свойства21,22. В массовых экспериментах молекулярные субсостояния завуалированы эффектом среднего ансамбля, а зондирование биомолекулярных взаимодействий ограничено. В отличие от этого, одномолекулярные методы обходят ограничения массовых экспериментов и позволяют детально охарактеризовать биомолекулярные взаимодействия. В частности, методы одномолекулярной визуализации широко используются для изучения ДНК-белковых и белок-белковых взаимодействий23. Одним из таких методов является ДНК-занавес, уникальный метод визуализации отдельных молекул, основанный на микрофлюидике и флуоресцентной микроскопии с полным внутренним отражением (TIRFM)24,25. В занавесе ДНК сотни отдельных молекул ДНК прикреплены к липидному бислою, что обеспечивает двумерное движение молекул ДНК за счет липидной текучести. При применении гидродинамического потока молекулы ДНК движутся вдоль потока на бислое и застревают в диффузионном барьере, где они выравниваются и растягиваются. В то время как ДНК окрашивается интеркалирующими агентами, вводятся флуоресцентно меченные белки, а TIRFM используется для визуализации взаимодействий белок-ДНК в режиме реального времени на уровне одной молекулы23. Платформа ДНК-занавеса облегчает наблюдение за перемещениями белков, такими как диффузия, транслокация и столкновение 26,27,28. Кроме того, ДНК-занавес может быть использован для картирования белков на ДНК с определенными позициями, ориентациями и топологиями или применен для изучения фазового разделения белков и нуклеиновых кислот 29,30,31.
В этой работе метод ДНК-занавеса используется для предоставления доказательств функции шаперонов путем прямой визуализации специфических белков. Более того, поскольку ДНК-занавес является платформой с высокой пропускной способностью, он облегчает сбор данных, достаточный для статистической надежности. В данной статье подробно описано, как проводить анализ ДНК-занавеса для изучения молекулярной роли бромдомен-содержащей S. pombe ААА+ АТФазы Abo1.
Protocol
Representative Results
Discussion
В качестве метода визуализации одной молекулы ДНК-занавес широко используется для исследования метаболических реакций ДНК43. Занавес ДНК представляет собой гибридную систему, объединяющую липидную текучесть, микрофлюидику и TIRFM. В отличие от других одномолекулярных мето?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы высоко оценивают любезную поддержку Abo1 и Cy5-H3-H4 со стороны профессора Джи-Джун Сонга, доктора философии Кэрол Чо и доктора философии Джувона Чана из KAIST, Южная Корея. Работа выполнена при поддержке гранта Национального исследовательского фонда (NRF-2020R1A2B5B01001792), фонда очных исследований (1.210115.01) Ульсанского национального института науки и технологий и Института фундаментальных наук (IBS-R022-D1).
Materials
| 1 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 301321 | |
| 1' x 3' fused-silca slide glass | G. Finkenbeiner | 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness | |
| 10 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302149 | |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 Biotinyl cap PE | Avanti | 870273 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | This is a component of biotinylated lipid stock |
| 3 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302832 | |
| 6-way sample injection valve | IDEX | MX series II | |
| 950K PMMA | All-resist | 671.04 | |
| Acetone | SAMCHUN | A1759 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | |
| Aluminum (Al) | TASCO, South Korea | LT50AI414 | Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch |
| Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
| Ampicillin | Mbcell | MB-A4128 | Antibiotics |
| AZ 300 MIF developer | Merck | 10454110521 | Used for removing aluminum |
| Blade | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
| Boron trichloride (BCl3) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Catalase | Sigma | C40-1g | This is a component of 100x gloxy stock |
| Chlorine (Cl2) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
| Clear double-sided tape | 3M | 313770 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
| DC sputter | Sorona | SRM-120 | Used for deposition aluminum on a slide |
| Diamond-coated drill bit | Eurotool | DIB-211.00 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| Dove-prism | Korea Electro-Optics Co. Ltd. | 1906-106 | Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 | Used for making holes in a fusced silica slide |
| Electron Bean Lithography | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
| Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
| Fingertight fittings | IDEX | F-300 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Flangeless male nut | IDEX | P-235 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
| Freeze Dryer, HyperCOOL | Labogene | HC3110 | Used for lyophilizing liquid proteins |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133-50KU | This is a component of 100x gloxy stock |
| Guanidinium hydrochloride | Acros Organics | 364790025 | |
| Hamilton syringe | Hamilton Company | 80065 | This syringe is used for sample injection |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
| HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Hot plate stirrer | Corning | PC-420D | |
| Hydrochloric acid | Sigma | H1759 | Used for Tris-HCl |
| Index matching oil | ZEISS | 444970-9000-000 | |
| Inductively coupled plasma-reactive ion etching | Top Technology Ltd. | FabStar | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Glentham Life Sciences | GC6586-100g | Used for induction of β-galactosidase activity |
| Lambda phage DNA | NEB | N0311 | |
| LB broth | BD difco | 244610 | Media for E.coli cell growth |
| Luer adapter 10-32 | IDEX | P-659 | This connects luer-lock syringe and tubing |
| Magnesium chloride hexahydrate | fisher bioreagents | BP214 | |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | KAYAKU ADVANCED MATERIALS | Used for developing solution | |
| Microscope (Eclipse Ti2) | Nikon | Eclipse Ti2 | Inverted fluorescence microscope |
| Microscope glass coverslip | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm (No. 1) |
| Microscope slide | DURAN GROUP | DU.2355013 | Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm |
| Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
| Objective lens | Nikon | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28) |
| One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C6060-03 | Competent cell for overexpressing proteins |
| Oxygen (O2) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| PFA tubing natural | IDEX | 1512L | It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche | 11359061001 | Protease inhibitor |
| Sephacryl S-200 High Resolution | Cytiva | 17-0584-01 | Used for FPLC (size exclusion) |
| Shut-off valve | IDEX | P-732 | |
| Sodium acetate | Sigma | 791741 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | s5881 | |
| Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa | Spectrum laboratories | 132660 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | S888 | |
| Sulfur tetralfluoride (SF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| Syringe pump | KD Scientific | 78-8210 | |
| Tetrafluoromethane (CF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | Used for Tris-HCl |
| TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | Used for FPLC (ion exchange) |
| Union assembly | IDEX | P-760 | This connects tubings |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Vacuum oven | Jeio Tech | OV-11 | |
| YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | This intercalation dye is diluted in DMSO |
| β-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M6250 |
References
- Woodcock, C. L., Ghosh, R. P. Chromatin higher-order structure and dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (5), 000596 (2010).
- Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure. Molecules and Cells. 42 (7), 512-522 (2019).
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
- McGhee, J. D., Felsenfeld, G. Nucleosome structure. Annual Review of Biochemistry. 49, 1115-1156 (1980).
- Takata, H., et al. Chromatin compaction protects genomic DNA from radiation damage. PLOS One. 8 (10), 75622 (2013).
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Peterson, C. L., Almouzni, G. Nucleosome dynamics as modular systems that integrate DNA damage and repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), 012658 (2013).
- Torigoe, S. E., Urwin, D. L., Ishii, H., Smith, D. E., Kadonaga, J. T. Identification of a rapidly formed nonnucleosomal histone-DNA intermediate that is converted into chromatin by ACF. Molecules and Cells. 43 (4), 638-648 (2011).
- Gurard-Levin, Z. A., Quivy, J. P., Almouzni, G. Histone chaperones: assisting histone traffic and nucleosome dynamics. Annual Review of Biochemistry. 83, 487-517 (2014).
- Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
- Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
- Hammond, C. M., Stromme, C. B., Huang, H., Patel, D. J., Groth, A. Histone chaperone networks shaping chromatin function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (3), 141-158 (2017).
- De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: an escort network regulating histone traffic. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
- Zou, J. X., Revenko, A. S., Li, L. B., Gemo, A. T., Chen, H. W. ANCCA, an estrogen-regulated AAA+ ATPase coactivator for ERalpha, is required for co-regulator occupancy and chromatin modification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18067-18072 (2007).
- Lombardi, L. M., Davis, M. D., Rine, J. Maintenance of nucleosomal balance in cis by conserved AAA-ATPase Yta7. Genetics. 199 (1), 105-116 (2015).
- Gal, C., et al. Abo1, a conserved bromodomain AAA-ATPase, maintains global nucleosome occupancy and organisation. EMBO Reports. 17 (1), 79-93 (2016).
- Cho, C., et al. Structural basis of nucleosome assembly by the Abo1 AAA+ ATPase histone chaperone. Nature Communications. 10 (1), 5764 (2019).
- Morozumi, Y., et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (4), 349-362 (2016).
- Zhang, M., Zhang, C., Du, W., Yang, X., Chen, Z. ATAD2 is overexpressed in gastric cancer and serves as an independent poor prognostic biomarker. Clinical and Translational Oncology. 18 (8), 776-781 (2016).
- Kang, Y., Cho, C., Lee, K. S., Song, J. J., Lee, J. Y. Single-molecule imaging reveals the mechanism underlying histone loading of schizosaccharomyces pombe AAA+ ATPase Abo1. Molecules and Cells. 44 (2), 79-87 (2021).
- Fried, M. G. Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay. Electrophoresis. 10 (5-6), 366-376 (1989).
- Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. Journal of Immunology. 115 (6), 1617-1624 (1975).
- Lu, H. P. Single-molecule study of protein-protein and protein-DNA interaction dynamics. Methods in Molecular Biology. 305, 385-414 (2005).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24 (18), 10524-10531 (2008).
- Kang, Y., et al. High-throughput single-molecule imaging system using nanofabricated trenches and fluorescent DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1640-1648 (2020).
- Cheon, N. Y., Kim, H. S., Yeo, J. E., Scharer, O. D., Lee, J. Y. Single-molecule visualization reveals the damage search mechanism for the human NER protein XPC-RAD23B. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8337-8347 (2019).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecules and Cells. 54 (5), 832-843 (2014).
- Kang, H. J., et al. TonEBP recognizes R-loops and initiates m6A RNA methylation for R-loop resolution. Nucleic Acids Research. 49 (1), 269-284 (2021).
- Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
- Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (10), 1056-1062 (2009).
- Stigler, J., Camdere, G. O., Koshland, D. E., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals a collapsed conformational state for DNA-bound cohesin. Cell Reports. 15 (5), 988-998 (2016).
- Thornton, J. A. Sputter Coating- Its Principles and Potential. SAE Transactions. 82, 1787-1805 (1973).
- Grigorescu, A. E., Hagen, C. W. Resists for sub-20-nm electron beam lithography with a focus on HSQ: state of the art. Nanotechnology. 20 (29), 292001 (2009).
- Meir, A., Kong, M., Xue, C., Greene, E. C. DNA curtains shed light on complex molecular systems during homologous recombination. Journal of Visualized Experiments. (160), e61320 (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols. Gloxy. Vol. 2. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Gracey, L. E., et al. An in vitro-identified high-affinity nucleosome-positioning signal is capable of transiently positioning a nucleosome in vivo. Epigenetics Chromatin. 3 (1), 13 (2010).
- Subtil-Rodriguez, A., Reyes, J. C. BRG1 helps RNA polymerase II to overcome a nucleosomal barrier during elongation, in vivo. EMBO Reports. 11 (10), 751-757 (2010).
- Lancrey, A., et al. Nucleosome positioning on large tandem DNA repeats of the ‘601’ sequence engineered in Saccharomyces cerevisiae. bioRxiv. , (2021).
- Perales, R., Zhang, L., Bentley, D. Histone occupancy in vivo at the 601 nucleosome binding element is determined by transcriptional history. Molecular and Cellular Biology. 31 (16), 3485-3496 (2011).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
- Rossmann, K. Point spread-function, line spread-function, and modulation transfer function. Tools for the study of imaging systems. Radiology. 93 (2), 257-272 (1969).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
- Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Teif, V. B., Rippe, K. Nucleosome mediated crosstalk between transcription factors at eukaryotic enhancers. Physical Biology. 8 (4), 044001 (2011).
