Decifrando o Mecanismo Molecular da Montagem de Histonas pela Técnica de Cortina de DNA

O DNA eucariótico é empacotado em uma estrutura de ordem superior conhecida como cromatina ^1,2. O nucleossomo é a unidade fundamental da cromatina, que consiste em aproximadamente 147 pb de DNA envolto em torno das histonas do núcleo octeramérica ^3,4. A cromatina desempenha um papel crítico em células eucarióticas; por exemplo, a estrutura compacta protege o DNA de fatores endógenos e ameaças exógenas⁵. A estrutura da cromatina muda dinamicamente de acordo com a fase do ciclo celular e estímulos ambientais, e essas alterações controlam o acesso às proteínas durante transações de DNA, como replicação, transcrição e reparo⁶. A dinâmica da cromatina também é importante para a estabilidade genômica e informações epigenéticas.

A cromatina é regulada dinamicamente por vários fatores, incluindo modificações na cauda de histonas e organizadores da cromatina, como remodeladores de cromatina, proteínas do grupo policomb e chaperonas de histonas⁷. As chaperonas de histonas coordenam a montagem e desmontagem de nucleossomos via deposição ou descolamento de histonas centrais ^8,9. Defeitos nas chaperonas de histonas induzem instabilidade do genoma e causam distúrbios do desenvolvimento e câncer ^9,10. Várias chaperonas de histonas não necessitam de consumo de energia química, como hidrólise de ATP, para montar ou desmontar nucleossomos 9,11,12,13. Recentemente, pesquisadores relataram que AAA+ contendo bromodomínio (ATPase associada a diversas atividades celulares) ATPases desempenham um papel na dinâmica da cromatina como chaperonas de histonas 14,15,16,17. A ATAD2 humana (ATPase family AAA domain-containing protein 2) promove a acessibilidade da cromatina para aumentar a expressão gênica¹⁸. Como co-regulador transcricional, o ATAD2 regula a cromatina dos fatores transcricionais oncogênicos¹⁴, e a superexpressão de ATAD2 está relacionada ao mau prognóstico em muitos tipos de câncer¹⁹. Yta7, o homólogo de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) de ATAD2, diminui a densidade nucleossômica na cromatina¹⁵. Em contraste, Abo1, o Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) homólogo de ATAD2, aumenta a densidade nucleossômica¹⁶. Usando uma técnica única de imagem de molécula única, a cortina de DNA, se Abo1 contribui para a montagem ou desmontagem do nucleossomo^é abordada ^17,20.

Tradicionalmente, as propriedades bioquímicas de biomoléculas têm sido examinadas por experimentos em massa, como o ensaio de deslocamento da mobilidade eletroforética (EMSA) ou a co-imunoprecipitação (co-IP), nos quais um grande número de moléculas é sondado e suas propriedades médias são^{caracterizadas21,22}. Em experimentos em massa, os sub-estados moleculares são velados pelo efeito ensemble-average, e a sondagem de interações biomoleculares é restrita. Em contraste, técnicas de molécula única contornam as limitações dos experimentos em massa e permitem a caracterização detalhada das interações biomoleculares. Em particular, técnicas de imagem de molécula única têm sido amplamente utilizadas para estudar interações DNA-proteína e proteína-proteína²³. Uma dessas técnicas é a cortina de DNA, uma técnica única de imagem de molécula única baseada em microfluídica e microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRFM)^24,25. Em uma cortina de DNA, centenas de moléculas individuais de DNA estão ancoradas à bicamada lipídica, o que permite o movimento bidimensional das moléculas de DNA devido à fluidez lipídica. Quando o fluxo hidrodinâmico é aplicado, as moléculas de DNA se movem ao longo do fluxo na bicamada e ficam presas em uma barreira de difusão, onde são alinhadas e esticadas. Enquanto o DNA é corado com agentes intercalantes, proteínas fluorescentemente marcadas são injetadas, e o TIRFM é usado para visualizar interações proteína-DNA em tempo real em nível de molécula^{única 23}. A plataforma de cortina de DNA facilita a observação de movimentos de proteínas como difusão, translocação e colisão 26,27,28. Além disso, a cortina de DNA pode ser utilizada para mapeamento de proteínas no DNA com posições, orientações e topologias definidas ou aplicada ao estudo da separação de fases de proteínas e ácidos nucléicos 29,30,31.

Neste trabalho, a técnica de cortina de DNA é usada para fornecer evidências da função de chaperonas através da visualização direta de proteínas específicas. Além disso, como a cortina de DNA é uma plataforma de alto rendimento, ela facilita uma extensão de coleta de dados suficiente para a confiabilidade estatística. Aqui, descreve-se como conduzir o ensaio de cortina de DNA em detalhes para investigar o papel molecular de S. pombe bromodomain contendo AAA+ ATPase Abo1.