Tandem İyon Hareketlilik Deneyleri için Döngüsel İyon Hareketlilik Spektrometresi Kullanma
Summary
İyon hareketlilik spektrometresi (IMS), biyomoleküllerin karakterizasyonu için kütle spektrometrisinin ilginç bir tamamlayıcısıdır, özellikle izomerizme duyarlı olduğu için. Bu protokol, bir molekülün izolasyonuna ve parçalarının hareketlilik profillerinin oluşturulmasına izin veren bir tandem IMS (IMS / IMS) deneyini tanımlar.
Abstract
Kimyasal yapıların doğru karakterizasyonu, altta yatan biyolojik mekanizmaları ve fonksiyonel özelliklerini anlamak için önemlidir. Kütle spektrometresi (MS) popüler bir araçtır, ancak tüm yapısal özellikleri tamamen ortaya çıkarmak için her zaman yeterli değildir. Örneğin, karbonhidratlar biyolojik olarak alakalı olmasına rağmen, karakterizasyonları sayısız izomerizm seviyesi ile karmaşıktır. İyon hareketlilik spektrometresi (IMS) ilginç bir tamamlayıcıdır çünkü iyon konformasyonlarına ve dolayısıyla izomerizme duyarlıdır.
Ayrıca, son gelişmeler tekniği önemli ölçüde geliştirmiştir: son nesil Döngüsel IMS cihazları, doğrusal IMS cihazlarına kıyasla, artan çözme gücü veya tandem iyon hareketliliği (IMS / IMS) deneyleri gerçekleştirme olasılığı gibi ek yetenekler sunmaktadır. IMS / IMS sırasında, bir iyon iyon hareketliliğine göre seçilir, parçalanır ve parçaları hakkında iyon hareketliliği bilgisi elde etmek için yeniden analiz edilir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, bu tür IMS / IMS verilerinde bulunan parçaların hareketlilik profillerinin, belirli bir glikanın parmak izi olarak hareket edebileceğini ve glikomik veri kümelerini yapısal olarak ilgili bir şekilde düzenlemek için moleküler bir ağ stratejisinde kullanılabileceğini göstermiştir.
Bu protokolün amacı, numune hazırlamadan, tekrarlanabilir spektrumlar veren iyon hareketlilik boyutunun son Çarpışma Kesiti (CCS) kalibrasyonuna kadar IMS / IMS verilerinin nasıl üretileceğini tanımlamaktır. Bir temsili glikan örneğini alarak, bu protokol bir Döngüsel IMS cihazı üzerinde bir IMS / IMS kontrol dizisinin nasıl oluşturulacağını, IMS varış zamanını sürüklenme zamanına (yani, iyonlara uygulanan etkili ayırma süresi) çevirmek için bu kontrol dizisinin nasıl hesaplanacağını ve ham verilerden ilgili hareketlilik bilgilerinin nasıl çıkarılacağını gösterecektir. Bu protokol, bir IMS/IMS deneyinin kritik noktalarını açıkça açıklamak ve böylece yeni Döngüsel IMS kullanıcılarının basit ve tekrarlanabilir alımlar gerçekleştirmesine yardımcı olmak için tasarlanmıştır.
Introduction
Biyomoleküllerin tam kimyasal karakterizasyonu, altta yatan biyolojik ve fonksiyonel özelliklerini anlamanın anahtarıdır. Bu amaçla, son yıllarda kimyasal yapıların biyolojik konsantrasyonlarda büyük ölçekli karakterizasyonunu amaçlayan “omik” bilimleri gelişmiştir. Proteomik ve metabolomikte MS, biyolojik ortamda bulunan yapısal heterojenliği çözmek için temel bir araç haline gelmiştir – özellikle duyarlılığı ve tandem MS (MS / MS) yoluyla yapısal bilgi sağlama yeteneği sayesinde. MS / MS stratejilerinde, bir iyon kütlesine göre seçilir, daha sonra parçalanır ve son olarak, molekülün parmak izini oluşturmak için parçalarının kütleleri elde edilir. MS/MS spektrumları, özellikle, spektral veritabanlarını1,2 eşleştirmek veya üst yapıları geçici olarak yeniden yapılandırmak için kullanılabilir3,4. Benzer spektrumların benzer bileşiklere ait olduğu varsayımı altında, MS / MS verileri, ilgili türleri benzerlik skoru ile birbirine bağlayan moleküler ağlar (MN’ler) oluşturmak için de kullanılabilir5,6.
Bununla birlikte, MS’in iyonların kütle-yük oranını (m / z) tespit etme konusundaki doğal özelliği nedeniyle, teknik (stereo) izomerizm aralığına giren bir dizi yapısal özelliğe kördür. Örneğin, karbonhidratlar, çoğu stereoizomerler veya hatta epimerler olan birkaç monosakkarit alt biriminden oluşur (örneğin, Glc vs Gal veya Glc vs Man). Bu alt birimler, bağlantının konumuna (regioizomerizm) ve anomerik karbonun sterik konfigürasyonuna (anomerizm) göre farklılık gösterebilen glikosidik bağlarla bağlanır. Bu özellikler, bağımsız MS’in karbonhidrat izomerleri arasında ayrım yapmasını zorlaştırır7 ve yüksek enerjili aktivasyon yöntemleri kullanılarak yalnızca regioizomerizm ele alınabilir8,9,10. Derevcilleştirme, stereoizomerik grupların eşdeğerliğini bozmak için bir seçenek olsa da11, kapsamlı numune hazırlama gerektirir. Bir başka, daha basit seçenek, MS’i IMS gibi izomerizme duyarlı analitik bir boyutla birleştirmektir.
Bu protokol, IMS’nin temel kavramlarına zaten aşina olan kullanıcılar için tasarlandığından ve ayrıntılı incelemeler başka bir yerde mevcut olduğundan12,13, IMS ilkelerine yalnızca kısa bir genel bakış burada verilmiştir. IMS, iyonların bir tampon gaz ve bir elektrik alanı ile etkileşimine dayanan ve sonuçta iyonları gaz fazı konformasyonlarına göre ayıran bir gaz fazı ayırma yöntemidir. Ticari aletlerde MS’e bağlı farklı IMS prensipleri bulunabilir: bazıları alternatif yüksek ve düşük elektrik alanlarında (alan asimetrik IMS, FAIMS) çalışırken, çoğu düşük alan sınırı içinde çalışır – özellikle sürüklenme tüpü IMS (DTIMS, doğrusal olarak azalan elektrik alanı), hareketli dalga IMS (TWIMS, simetrik potansiyel dalgalar) ve sıkışmış IMS (TIMS, elektrik alanlarına karşı tampon gazı yakalama iyonlarının yüksek akışı)13 . Düşük alan yöntemleri, ayırma sırasında tampon gazı ile etkileşime giren iyonun yüzeyini (Å2 veya nm2 cinsinden) temsil eden iyon-gaz çiftinin bir özelliği olan CCS’ye erişime izin verir. CCS teorik olarak cihazdan bağımsızdır ve bu nedenle farklı laboratuvarlar arasında çoğaltılabilecek veriler üretmek için yararlıdır14. İyon hareketliliği ayırmaları, çeşitli parametrelerden ve özellikle hareketlilik hücresindeki gaz basıncı ve gaz sıcaklığındaki dalgalanmalardan etkilenebilir. CCS kalibrasyonu bunu düzeltmenin bir yoludur, çünkü hem kalibrant hem de ilgili türler benzer şekilde etkilenecektir13. Bununla birlikte, cihazın sıcaklık kontrollü bir odaya monte edilmesi ve güvenilir bir gaz basıncı kontrol sistemine sahip olması zorunludur.
IMS’nin ilginç bir evrimi, ilk olarak 2006 yılında Clemmer’in grubu tarafından MS / MS15,16’nın bir analoğu olarak tanıtılan IMS / IMS’dir. IMS / IMS’de, ilgilenilen bir iyon, iyon hareketliliğine bağlı olarak seçici olarak izole edilir; daha sonra aktive edilir (olası parçalanmaya kadar) ve aktive edilen iyonun veya parçaların yeni bir IMS analizi gerçekleştirilir. İlk enstrümantal tasarımda, aktivasyonun durduğu bir iyon hunisi ile ayrılan iki IMS hücresi seri olarak yerleştirildi. O zamandan beri, bir dizi IMS / IMS kurulumu önerilmiş olsa da (bir inceleme için Eldrid ve Thalassinos17’ye bakınız), IMS / IMS özelliğine sahip ilk ticari kütle spektrometresi yalnızca 201918’de kullanıma sunuldu. Bu cihaz, ilk konsepti başka bir teknolojik atılımla birleştirerek önemli ölçüde geliştirdi: IMS hücresinin döngüsel tasarımı.
Döngüsel IMS hücresi teorik olarak sürüklenme yolu uzunluğunun ve dolayısıyla cihazın çözme gücünün neredeyse sonsuz olarak artmasına izin verir19. Bu, döngüsel TWIMS hücresinin ana iyon optik eksenine ortogonal olarak yerleştirildiği belirli bir alet geometrisi ile elde edildi. IMS hücresinin girişindeki çok işlevli bir dizi bölgesi, iyon yolunun yönünü kontrol etmeyi sağlar: (i) iyonları IMS ayrımı için yana doğru göndermek, (ii) MS algılaması için ileri veya (iii) IMS hücresinden geriye doğru bir dizi öncesi hücrede saklanmak. Bu ön dizi depo hücresinden, iyonlar aktive edilebilir ve fragmanlar, stereoizomerleri20 karakterize etmek için başarıyla kullanılan bir yaklaşım olan iyon hareketliliği ölçümü için IMS hücresine yeniden enjekte edilebilir. Nihayetinde, toplanan veriler öncü ve parçaları için iyon hareketliliği ve m / z bilgilerini içerir.
Bu döngüsel tasarımı glikan analizleri için kullanan yakın tarihli bir yayında (Ollivier ve ark.21), bu tür IMS / IMS verilerinde bulunan parçaların hareketlilik profilinin, moleküler bir ağ stratejisinde kullanılabilecek bir biyomolekülün parmak izi gibi davrandığını gösterdik. IM-MN adı verilen ortaya çıkan ağ, glikomik veri kümelerinin yapısal olarak ilgili bir şekilde düzenlenmesine yol açarken, yalnızca MS / MS verilerinden (MS-MN) oluşturulan ağ çok az bilgi ortaya çıkardı. Bu yayını tamamlamak ve Döngüsel IMS kullanıcılarının bu iş akışını uygulamasına yardımcı olmak için bu protokol, verileri toplamak için kullanılan protokolün tam bir açıklamasını sağlar. Bu protokol yalnızca kullanıcıların IM-MN ağları oluşturmak için kullanabilecekleri IMS/IMS verilerinin oluşturulmasına odaklanır (bkz. 21) veya seçtikleri başka bir uygulama için. IM-MN’nin oluşturulması burada dikkate alınmayacaktır, çünkü moleküler ağ protokolleri zaten mevcuttur22. Değerli ve tekrarlanabilir IMS/IMS satın alımları oluşturmak için uyulması gereken önemli noktalar vurgulanmaktadır. Ollivier ve ark. tarafından incelenen oligosakkaritlerden birinin örneğini ele alalım. 21, aşağıdaki adımlar detaylandırılmıştır: (i) numune hazırlama, (ii) Döngüsel IMS cihazının ayarı, (iii) verilerin otomatik pik toplama ve (iv) CCS kalibrasyonu.
Protocol
Representative Results
Discussion
SELECT SERİSİ Döngüsel IMS, yukarı akış kromatografik ayrımına gerek kalmadan belirli bir m/z ve iyon hareketliliğinin tanımlanmış bir iyon popülasyonunun seçilmesini sağlayan güçlü bir araçtır. Cihaz, hem MS / MS hem de IMS / IMS spektrumlarının çıkarılabileceği bu iyon popülasyonunun iki boyutlu parçalanma haritasını oluşturma imkanı sunar. Bununla birlikte, kullanıcı deneysel süreç sırasında dikkat edilmesi gereken birkaç kritik noktaya dikkat etmelidir.
<p class="j…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.O., doktorasını finanse ettiği için Fransız Ulusal Araştırma Ajansı’na müteşekkirdir (hibe ANR-18-CE29-0006).
Materials
| 33-α-L- plus 23-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) mixture | Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland | O-XAXXMIX | XA2XX + XA3XX mixture |
| 33-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX) | Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland | O-XA3XX | Pure XA3XX standard |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, colorless, 1,000 tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030120086 | Used to prepare the carbohydrate stock solution and dilution |
| FALCON 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm | Corning Science México S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico | 352070 | Used to prepare the aqueous stock solution of 100 mM LiCl |
| Lithium Chloride (ACS reagent, ≥99 %) | Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France | 310468 | Used to dope the sample with lithium |
| Major Mix IMS/Tof Calibration Kit | Waters Corp., Wilmslow, UK | 186008113 | Calibration solution for MS and IMS |
| MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9) | Waters Corp., Wilmslow, UK | 721022377 | Cyclic IMS vendor software for instrument control and data processing |
| Methanol for HPLC PLUS Gradient grade | Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France | 412383 | High-purity solvent |
| MS Leucine Enkephaline Kit | Waters Corp., Wilmslow, UK | 700002456 | Reference compound used for tuning of the mass spectrometer |
| SCHOTT DURAN 100 mL borosilicate glass bottle | VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US | 218012458 | Used to prepare the solution of 500 µM LiCl in 50:50 MeOH/Water |
| SELECT SERIES Cyclic IMS | Waters Corp., Wilmslow, UK | 186009432 | Ion mobility-mass spectrometer equipped with a cylic IMS cell |
| Website: http://mzmine.github.io/ | MZmine Development Team | – | Link to download the MZmine software |
| Website: https://github.com/siollivier/IM-MN | INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, France | – | Link to an in-house R script containing a CCS calibration function |
References
- Allard, P. -. M., et al. Integration of molecular networking and in-silico MS/MS fragmentation for natural products dereplication. Analytical Chemistry. 88 (6), 3317-3323 (2016).
- Wang, M., et al. Mass spectrometry searches using MASST. Nature Biotechnology. 38 (1), 23-26 (2020).
- David, M., Fertin, G., Rogniaux, H., Tessier, D. SpecOMS: a full open modification search method performing all-to-all spectra comparisons within minutes. Journal of Proteome Research. 16 (8), 3030-3038 (2017).
- Dührkop, K., et al. SIRIUS 4: a rapid tool for turning tandem mass spectra into metabolite structure information. Nature Methods. 16 (4), 299-302 (2019).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Nothias, L. -. F., et al. Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment. Nature Methods. 17 (9), 905-908 (2020).
- Gray, C. J., et al. Advancing solutions to the Carbohydrate Sequencing Challenge. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14463-14479 (2019).
- Ropartz, D., et al. Online coupling of high-resolution chromatography with extreme UV photon activation tandem mass spectrometry: Application to the structural investigation of complex glycans by dissociative photoionization. Analytica Chimica Acta. 933, 1-9 (2016).
- Wolff, J. J., et al. Negative electron transfer dissociation of glycosaminoglycans. Analytical Chemistry. 82 (9), 3460-3466 (2010).
- Ropartz, D., et al. Charge transfer dissociation of complex oligosaccharides: comparison with collision-induced dissociation and extreme ultraviolet dissociative photoionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (10), 1614-1619 (2016).
- Morelle, W., et al. Fragmentation characteristics of permethylated oligosaccharides using a matrix-assisted laser desorption/ionization two-stage time-of-flight (TOF/TOF) tandem mass spectrometer. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 18 (22), 2637-2649 (2004).
- Gabelica, V., Marklund, E. Fundamentals of ion mobility spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 42, 51-59 (2018).
- Gabelica, V., et al. Recommendations for reporting ion mobility mass spectrometry measurements. Mass Spectrometry Reviews. 38 (3), 291-320 (2019).
- Hernandez-Mesa, M., et al. Interlaboratory and interplatform study of steroids collision cross section by traveling wave ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (7), 5013-5022 (2020).
- Koeniger, S. L., et al. An IMS-IMS analogue of MS-MS. Analytical Chemistry. 78 (12), 4161-4174 (2006).
- Merenbloom, S. I., Koeniger, S. L., Valentine, S. J., Plasencia, M. D., Clemmer, D. E. IMS−IMS and IMS−IMS−IMS/MS for separating peptide and protein fragment ions. Analytical Chemistry. 78 (8), 2802-2809 (2006).
- Eldrid, C., Thalassinos, K. Developments in tandem ion mobility mass spectrometry. Biochemical Society Transactions. 48 (6), 2457-2466 (2020).
- Giles, K., et al. A cyclic ion mobility-mass spectrometry system. Analytical Chemistry. 91 (13), 8564-8573 (2019).
- Merenbloom, S. I., Glaskin, R. S., Henson, Z. B., Clemmer, D. E. High-resolution ion cyclotron mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (4), 1482-1487 (2009).
- Ollivier, S., et al. Anomeric retention of carbohydrates in multistage cyclic ion mobility (IMSn): de novo structural elucidation of enzymatically produced mannosides. Analytical Chemistry. 93 (15), 6254-6261 (2021).
- Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Molecular networking of high-resolution tandem ion mobility spectra: a structurally relevant way of organizing data in glycomics. Analytical Chemistry. 93 (31), 10871-10878 (2021).
- Aron, A. T., et al. Reproducible molecular networking of untargeted mass spectrometry data using GNPS. Nature Protocols. 15 (6), 1954-1991 (2020).
- McKenna, K. R., Li, L., Krishnamurthy, R., Liotta, C. L., Fernández, F. M. Organic acid shift reagents for the discrimination of carbohydrate isobars by ion mobility-mass spectrometry. The Analyst. 145 (24), 8008-8015 (2021).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
- Ruotolo, B. T., Benesch, J. L. P., Sandercock, A. M., Hyung, S. -. J., Robinson, C. V. Ion mobility-mass spectrometry analysis of large protein complexes. Nature Protocols. 3 (7), 1139-1152 (2008).
- Bush, M. F., Hall, Z., Giles, K., Hoyes, J., Robinson, C. V., Ruotolo, B. T. Collision cross sections of proteins and their complexes: a calibration framework and database for gas-phase structural biology. Analytical Chemistry. 82 (22), 9557-9565 (2010).
- Ropartz, D., et al. Structure determination of large isomeric oligosaccharides of natural origin through multipass and multistage cyclic traveling-wave ion mobility mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (18), 12030-12037 (2019).
- Tolmachev, A. V., et al. Characterization of ion dynamics in structures for lossless ion manipulations. Analytical Chemistry. 86 (18), 9162-9168 (2014).
- Arndt, J. R., et al. High-resolution ion-mobility-enabled peptide mapping for high-throughput critical quality attribute monitoring. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (8), 2019-2032 (2021).
- Le Fèvre, A., Dugourd, P., Chirot, F. Exploring conformational landscapes using trap and release tandem ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (9), 4183-4190 (2021).
- Ohshimo, K., He, X., Ito, R., Misaizu, F. Conformer separation of dibenzo-crown-ether complexes with Na+ and K+ ions studied by cryogenic ion mobility-mass spectrometry. The Journal of Physical Chemistry A. 125 (17), 3718-3725 (2021).
- Purves, R. W., Barnett, D. A., Ells, B., Guevremont, R. Gas-phase conformers of the [M + 2H]2+ ion of bradykinin investigated by combining high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry, hydrogen/deuterium exchange, and energy-loss measurements. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 15 (16), 1453-1456 (2001).
- Ujma, J., et al. Cyclic ion mobility mass spectrometry distinguishes anomers and open-ring forms of pentasaccharides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (6), 1028-1037 (2019).
- Warnke, S., Faleh, A. B., Scutelnic, V., Rizzo, T. R. Separation and identification of glycan anomers using ultrahigh-resolution ion-mobility spectrometry and cryogenic ion spectroscopy. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 30 (11), 2204-2211 (2019).
- Williamson, D. L., Bergman, A. E., Nagy, G. Investigating the structure of α/β carbohydrate linkage isomers as a function of group I metal adduction and degree of polymerization as revealed by cyclic ion mobility separations. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (10), 2573-2582 (2021).
- Myers, O. D., Sumner, S. J., Li, S., Barnes, S., Du, X. One step forward for reducing false positive and false negative compound identifications from mass spectrometry metabolomics data: new algorithms for constructing extracted ion chromatograms and detecting chromatographic peaks. Analytical Chemistry. 89 (17), 8696-8703 (2017).
- Marchand, A., Livet, S., Rosu, F., Gabelica, V. Drift tube ion mobility: how to reconstruct collision cross section distributions from arrival time distributions. Analytical Chemistry. 89 (23), 12674-12681 (2017).
- Davis, D. M., et al. Analysis of ion mobility spectra for mixed vapors using Gaussian deconvolution. Analytica Chimica Acta. 289 (3), 263-272 (1994).
- Polasky, D. A., Dixit, S. M., Fantin, S. M., Ruotolo, B. T. CIUSuite 2: next-generation software for the analysis of gas-phase protein unfolding data. Analytical Chemistry. 91 (4), 3147-3155 (2019).
- Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1181-1193 (2012).
- Gelb, A. S., Jarratt, R. E., Huang, Y., Dodds, E. D. A study of calibrant selection in measurement of carbohydrate and peptide ion-neutral collision cross sections by traveling wave ion mobility spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (22), 11396-11402 (2014).
- Richardson, K., Langridge, D., Dixit, S. M., Ruotolo, B. T. An improved calibration approach for traveling wave ion mobility spectrometry: robust, high-precision collision cross sections. Analytical Chemistry. 93 (7), 3542-3550 (2021).
