Summary

Utilisation d’un spectromètre de mobilité ionique cyclique pour les expériences de mobilité ionique en tandem

Published: January 20, 2022
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Summary

La spectrométrie de mobilité ionique (IMS) est un complément intéressant à la spectrométrie de masse pour la caractérisation des biomolécules, notamment parce qu’elle est sensible à l’isomérisme. Ce protocole décrit une expérience IMS en tandem (IMS/IMS), qui permet l’isolement d’une molécule et la génération des profils de mobilité de ses fragments.

Abstract

Une caractérisation précise des structures chimiques est importante pour comprendre leurs mécanismes biologiques sous-jacents et leurs propriétés fonctionnelles. La spectrométrie de masse (SEP) est un outil populaire mais n’est pas toujours suffisante pour dévoiler complètement toutes les caractéristiques structurelles. Par exemple, bien que les glucides soient biologiquement pertinents, leur caractérisation est compliquée par de nombreux niveaux d’isomérisme. La spectrométrie de mobilité ionique (IMS) est un complément intéressant car elle est sensible aux conformations ioniques et, par conséquent, à l’isomérisme.

En outre, les progrès récents ont considérablement amélioré la technique : la dernière génération d’instruments IMS cycliques offre des capacités supplémentaires par rapport aux instruments IMS linéaires, telles qu’un pouvoir de résolution accru ou la possibilité d’effectuer des expériences de mobilité ionique en tandem (IMS/IMS). Au cours de l’IMS/IMS, un ion est sélectionné en fonction de sa mobilité ionique, fragmenté et réanalysé pour obtenir des informations sur la mobilité ionique de ses fragments. Des travaux récents ont montré que les profils de mobilité des fragments contenus dans ces données IMS/IMS peuvent agir comme une empreinte digitale d’un glycane particulier et peuvent être utilisés dans une stratégie de réseau moléculaire pour organiser les ensembles de données glycomiques d’une manière structurellement pertinente.

L’objectif de ce protocole est donc de décrire comment générer des données IMS/IMS, de la préparation de l’échantillon à l’étalonnage final de la section transversale de collision (CCS) de la dimension de mobilité ionique qui donne des spectres reproductibles. En prenant l’exemple d’un glycane représentatif, ce protocole montrera comment construire une séquence de contrôle IMS/IMS sur un instrument IMS cyclique, comment tenir compte de cette séquence de contrôle pour traduire le temps d’arrivée IMS en temps de dérive (c’est-à-dire le temps de séparation efficace appliqué aux ions) et comment extraire les informations de mobilité pertinentes des données brutes. Ce protocole est conçu pour expliquer clairement les points critiques d’une expérience IMS/IMS et ainsi aider les nouveaux utilisateurs d’IMS cycliques à effectuer des acquisitions simples et reproductibles.

Introduction

La caractérisation chimique complète des biomolécules est essentielle pour comprendre leurs propriétés biologiques et fonctionnelles sous-jacentes. À cette fin, les sciences « omiques » se sont développées ces dernières années, visant la caractérisation à grande échelle des structures chimiques à des concentrations biologiques. En protéomique et en métabolomique, la SEP est devenue un outil essentiel pour démêler l’hétérogénéité structurelle des milieux biologiques, notamment grâce à sa sensibilité et à sa capacité à fournir des informations structurelles par le biais de la SEP tandem (MS/MS). Dans les stratégies MS/MS, un ion est sélectionné en fonction de sa masse, puis fragmenté, et enfin, les masses de ses fragments sont acquises pour établir une empreinte digitale de la molécule. Les spectres MS/MS peuvent, en particulier, être utilisés pour faire correspondre les bases de données spectrales1,2, ou reconstruire provisoirement les structures parentes3,4. En supposant que des spectres similaires appartiennent à des composés similaires, les données MS/MS peuvent également être utilisées pour construire des réseaux moléculaires (MN) reliant des espèces apparentées grâce à un score de similitude5,6.

Cependant, en raison de la propriété inhérente de la SEP de détecter le rapport masse/charge (m/z) des ions, la technique est aveugle à un certain nombre de caractéristiques structurelles qui entrent dans la gamme de l’isomérisme (stéréo). Par exemple, les glucides sont constitués de plusieurs sous-unités monosaccharidiques, dont beaucoup sont des stéréoisomères ou même des épimères (par exemple, Glc vs Gal ou Glc vs Man). Ces sous-unités sont liées par des liaisons glycosidiques, qui peuvent différer par la position de la liaison (régioisomérisme) et la configuration stérique du carbone anomérique (anomérisme). Ces caractéristiques font qu’il est difficile pour la SEP autonome de faire la distinction entre les isomères glucidiques7, et seul le régioisomérisme peut être traité à l’aide de méthodes d’activation à haute énergie8,9,10. Bien que la dérivatisation soit une option pour perturber l’équivalence des groupes stéréoisomériques11, elle nécessite une préparation approfondie des échantillons. Une autre option, plus simple, consiste à coupler la SEP avec une dimension analytique sensible à l’isomérisme, telle que l’IMS.

Étant donné que ce protocole est conçu pour les utilisateurs qui connaissent déjà les concepts de base du SGI et que des examens détaillés sont disponibles ailleurs12,13, seul un bref aperçu des principes du SGI est donné ici. IMS est une méthode de séparation en phase gazeuse qui repose sur l’interaction des ions avec un gaz tampon et un champ électrique, séparant finalement les ions en fonction de leurs conformations en phase gazeuse. Différents principes d’IMS couplés à MS peuvent être trouvés sur les instruments commerciaux: certains fonctionnent à des champs électriques alternés élevés et faibles (IMS asymétriques de champ, FAIMS), tandis que la plupart fonctionnent dans la limite de champ bas, notamment IMS à tube de dérive (DTIMS, champ électrique décroissant linéaire), IMS à ondes mobiles (TWIMS, ondes de potentiel symétriques) et IMS piégés (TIMS, flux élevé d’ions piégeant les gaz tampons contre les champs électriques)13 . Les méthodes à faible champ permettent d’accéder à ce que l’on appelle un CCS, une propriété de la paire ion-gaz qui représente la surface (en Å2 ou nm2) de l’ion qui interagit avec le gaz tampon pendant la séparation. Le CSC est théoriquement indépendant de l’instrument et est donc utile pour générer des données qui peuvent être reproduites entre différents laboratoires14. Les séparations de mobilité ionique peuvent être influencées par divers paramètres et, notamment, par les fluctuations de la pression et de la température du gaz dans la cellule de mobilité. L’étalonnage CCS est un moyen d’y remédier, car le calibrant et l’espèce d’intérêt seront affectés de la même manière13. Cependant, il est obligatoire d’installer l’instrument dans une pièce à température contrôlée et de disposer d’un système de contrôle de la pression de gaz fiable.

Une évolution intéressante de l’IMS est IMS/IMS, qui a été introduit pour la première fois en 2006 par le groupe de Clemmer en tant qu’analogue de MS/MS15,16. Dans IMS/IMS, un ion d’intérêt est isolé de manière sélective en fonction de sa mobilité ionique; il est ensuite activé (jusqu’à fragmentation possible), et une nouvelle analyse IMS de l’ion ou des fragments activés est effectuée. Dans la première conception instrumentale, deux cellules IMS ont été placées en série, séparées par un entonnoir ionique où se trouvait l’activation. Depuis lors, bien qu’un certain nombre de configurations IMS / IMS aient été proposées (pour un examen, voir Eldrid et Thalassinos17), le premier spectromètre de masse commercial doté de la capacité IMS / IMS n’est devenu disponible qu’en 201918. Cet instrument a considérablement amélioré le concept initial en le combinant avec une autre percée technologique : une conception cyclique de la cellule IMS.

La cellule IMS cyclique permet théoriquement d’augmenter presque à l’infini la longueur du trajet de dérive et, par conséquent, le pouvoir de résolution de l’instrument19. Ceci a été réalisé au moyen d’une géométrie d’instrument particulière, où la cellule TWIMS cyclique est placée orthogonalement à l’axe optique ionique principal. Une région de réseau multifonction à l’entrée de la cellule IMS permet de contrôler la direction du trajet ionique: (i) envoyer des ions latéralement pour la séparation IMS, (ii) vers l’avant pour la détection MS, ou (iii) vers l’arrière de la cellule IMS pour être stockés dans une cellule de préréseau. À partir de cette cellule de stockage prérésistante, les ions peuvent être activés et les fragments réinjectés dans la cellule IMS pour la mesure de la mobilité ionique, une approche qui a été utilisée avec succès pour caractériser les stéréoisomères20. En fin de compte, les données collectées contiennent des informations sur la mobilité ionique et m/z pour le précurseur et ses fragments.

Dans une publication récente qui a utilisé cette conception cyclique pour les analyses de glycanes (Ollivier et al.21), nous avons montré que le profil de mobilité des fragments contenus dans ces données IMS / IMS agit comme une empreinte digitale d’une biomolécule qui peut être utilisée dans une stratégie de réseau moléculaire. Le réseau qui en a résulté, appelé IM-MN, a conduit à l’organisation des ensembles de données glycomiques d’une manière structurellement pertinente, tandis que le réseau construit uniquement à partir de données MS / MS (MS-MN) a révélé peu d’informations. Pour compléter cette publication et aider les utilisateurs de Cyclic IMS à implémenter ce flux de travail, ce protocole fournit une description complète du protocole utilisé pour collecter les données. Ce protocole se concentre uniquement sur la génération des données IMS/IMS que les utilisateurs peuvent ensuite utiliser pour créer des réseaux IM-MN (voir 21), ou pour toute autre application de leur choix. La construction de l’IM-MN ne sera pas envisagée ici, car des protocoles de mise en réseau moléculaire sont déjà disponibles22. Les points cruciaux qui doivent être suivis pour générer des acquisitions IMS/IMS précieuses et reproductibles sont mis en évidence. Prenant l’exemple d’un des oligosaccharides étudiés par Ollivier et al. 21, les étapes suivantes sont détaillées : (i) préparation de l’échantillon, (ii) réglage de l’instrument IMS cyclique, (iii) prélèvement automatisé des pics des données et (iv) étalonnage CCS.

Protocol

REMARQUE : Une vue d’ensemble du protocole est fournie à la figure 1. Les paramètres utilisés pour les expériences décrites dans le présent protocole se trouvent dans le tableau supplémentaire S1 et le tableau supplémentaire S2. 1. Préparation de la solution d’échantillon NOTE: Le protocole est décrit en utilisant un pentasaccharide arabinoxylane (23-α-L-arabinofuranosyl-x…

Representative Results

Un pentasaccharide arabinoxylane, XA2XX, a été choisi comme exemple pour illustrer ce protocole. Ce composé est disponible dans le commerce, mais uniquement sous forme de mélange avec un autre pentasaccharide arabinoxylane, XA3XX (le XA3XX pur est également disponible dans le commerce). Les structures de XA2XX et XA3XX sont données dans la figure supplémentaire S1. Comme le rapport entre XA2XX et XA3XX dans le mélange co…

Discussion

L’IMS cyclique SELECT SERIES est un outil puissant qui permet de sélectionner une population d’ions définie , d’une mobilité m/z et ionique donnée , sans avoir besoin d’une séparation chromatographique en amont. L’instrument offre la possibilité de générer une carte de fragmentation bidimensionnelle de cette population d’ions, à partir de laquelle les spectres MS/MS et IMS/IMS peuvent être extraits. Cependant, l’utilisateur doit noter plusieurs points critiques qui nécessitent une attent…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S.O. est reconnaissant à l’Agence nationale de la recherche Français pour le financement de son doctorat (subvention ANR-18-CE29-0006).

Materials

33-α-L- plus 23-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) mixture Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XAXXMIX XA2XX + XA3XX mixture
33-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX) Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland O-XA3XX Pure XA3XX standard
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, colorless, 1,000 tubes Eppendorf, Hamburg, Germany 0030120086 Used to prepare the carbohydrate stock solution and dilution
FALCON 50 mL Polypropylene Conical Tube 30 x 115 mm Corning Science México S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico 352070 Used to prepare the aqueous stock solution of 100 mM LiCl
Lithium Chloride (ACS reagent, ≥99 %) Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France 310468 Used to dope the sample with lithium
Major Mix IMS/Tof Calibration Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 186008113 Calibration solution for MS and IMS
MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6 (Waters Embedded Analyser Platform for Cyclic IMS 2.9.1 Release 9) Waters Corp., Wilmslow, UK 721022377 Cyclic IMS vendor software for instrument control and data processing
Methanol for HPLC PLUS Gradient grade Carlo-Erba Reagents, Val de Reuil, France 412383 High-purity solvent
MS Leucine Enkephaline Kit Waters Corp., Wilmslow, UK 700002456 Reference compound used for tuning of the mass spectrometer
SCHOTT DURAN 100 mL borosilicate glass bottle VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US 218012458 Used to prepare the solution of 500 µM LiCl in 50:50 MeOH/Water
SELECT SERIES Cyclic IMS Waters Corp., Wilmslow, UK 186009432 Ion mobility-mass spectrometer equipped with a cylic IMS cell
Website: http://mzmine.github.io/ MZmine Development Team Link to download the MZmine software
Website: https://github.com/siollivier/IM-MN INRAE, UR BIA, BIBS Facility, Nantes, France Link to an in-house R script containing a CCS calibration function

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Cite This Article
Ollivier, S., Fanuel, M., Rogniaux, H., Ropartz, D. Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments. J. Vis. Exp. (179), e63451, doi:10.3791/63451 (2022).

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