植物の根に土壌媒介微生物を感染させる接種戦略
Summary
このプロトコルは、植物の根に土壌媒介微生物を接種するための戦略の詳細な要約を提示する。真菌 Verticillium longisporum および Verticillium dahliaeについて例示された、3つの異なる根感染系が記載されている。潜在的なアプリケーションと可能なダウンストリーム解析が強調表示され、各システムについて長所または短所が議論されます。
Abstract
根圏には、植物の根が常に挑戦されている非常に複雑な微生物群集があります。根は多種多様な微生物と密接に接触しているが、土壌媒介相互作用に関する研究は地上の臓器で行われている研究にはまだ遅れをとっている。モデル植物をモデル根病原体に感染させるためのいくつかの接種戦略が文献に記載されているが、包括的な方法論的概要を得ることは依然として困難である。この問題に対処するために、根と微生物の相互作用の生物学への洞察を得るために適用することができる3つの異なる根接種システムが正確に記述されている。説明のために、 Verticillium 種(すなわち、 V. longisporum および V. dahliae)を根侵入モデル病原体として使用した。しかし、この方法は、病原性および有益な他の根コロニー形成微生物に容易に適合させることができる。植物の木部に定着することにより、 バーティシリウム 属などの維管束性土壌媒介性真菌は独特の生活様式を示す。根の侵入後、それらは木部血管 を介して 無作為に広がり、芽に達し、そして病気の症状を誘発する。モデル宿主として、 シロイヌナズナ、経済的に重要な油糧種子菜種(アブラナナ)、トマト(Solanum lycopersicum)の3つの代表的な植物種が選ばれた。ステップバイステップのプロトコルが与えられます。病原性アッセイ、マーカー遺伝子の転写解析、およびレポーター構築物による独立した確認の代表的な結果が示されている。さらに、各接種系の長所と短所を徹底的に議論する。これらの実証済みのプロトコルは、根と微生物の相互作用に関する研究上の質問に対するアプローチを提供するのに役立ちます。植物が土壌中の微生物にどのように対処するかを知ることは、農業を改善するための新しい戦略を開発するために不可欠です。
Introduction
天然土壌には、植物にとって中性、有害、または有益な驚くほど多くの微生物が生息しています1。多くの植物病原菌は土壌に生着し、根を囲み、地下の器官を攻撃する。これらの微生物は、真菌、卵菌類、細菌、線虫、昆虫、およびいくつかのウイルス1,2の多種多様なクレードに属する。環境条件が感染に有利になると、影響を受けやすい植物は病気になり、作物収量は減少します。地球温暖化や極端な気象などの気候変動の影響により、土壌に媒介する植物病原菌の割合が増加します3。したがって、これらの破壊的な微生物と、それらが食料や飼料の生産だけでなく、自然の生態系に与える影響を研究することはますます重要になります。さらに、土壌中には根と密接に相互作用し、植物の成長、発達、免疫を促進する微生物の相互主義者がいます。病原体に直面したとき、植物は病原体を抑制することによって宿主の生存をサポートできる根圏内の特定の敵を積極的に募集することができる4、5、6、7。しかし、有益な根と微生物の相互作用に関与する機構的な詳細と経路は、しばしばまだ不明である6。
したがって、根と微生物の相互作用の一般的な理解を広げることが不可欠です。土壌媒介微生物を根に接種するための信頼できる方法は、モデル研究を行い、その結果を農業用途に移転するために必要である。土壌中の有益な相互作用は、例えば、セレンディピタ・インディカ(以前はピリホルモスポラ・インディカとして知られていた)、窒素固定リゾビウム属、または菌根菌との研究されているが、既知の土壌媒介性植物病原体には、ラルストニア・ソラナセアラム、フィトフトラ属、フザリウム属、およびバーティシリウム属が含まれる。後者の2つは、世界中に分布し、血管疾患を引き起こす真菌属である2。Verticillium spp.(Ascomycota)は、何百もの植物種に感染する可能性があります – 草本一年生植物、木質多年生植物、および多くの作物植物を含む主に双子葉類2,8。Verticilliumの菌糸は根に入り、中央シリンダーに向かって細胞間および細胞内の両方で成長し、木部血管2,9に定着する。これらの血管では、真菌はそのライフサイクルのほとんどに留まる。木部樹液は栄養価が低く、植物防御化合物を運ぶので、真菌はこのユニークな環境に適応しなければなりません。これは、病原体がその宿主で生存することを可能にするコロニー形成関連タンパク質の分泌によって達成される10,11。根の血管系に到達した後、真菌は木部血管内で葉に無作為に広がることができ、これは宿主9,12の全身コロニー形成をもたらす。この時点で、植物は成長9、10、13に悪影響を受けます。例えば、発育不全および黄色い葉は、早期老化と同様に起こる13,14,15,16。
この属のメンバーの1つはVerticillium longisporumであり、これは農業学的に重要な油糧種子菜種、カリフラワー、およびモデル植物シロイヌナズナ12などのアブラナ科宿主に高度に適応している。いくつかの研究は、V. longisporumとA. thalianaを組み合わせて、土壌媒介性血管疾患およびその結果生じる根防御応答に関する広範な洞察を得た13,15,16,17。V. longisporum / A. thalianaモデルシステムを使用することによって、簡単な感受性試験を実現することができ、十分に確立された遺伝資源が両方の生物に利用可能である。V. longisporumと密接に関連しているのは、病原体Verticillium dahliaeである。両方の真菌種は同様の血管ライフスタイルおよび侵入プロセスを実行するが、根から葉へのそれらの増殖効率およびA. thalianaにおける誘発された疾患症状は異なる:V. longisporumは通常早期老化を誘発するが、V. dahliae感染は萎縮をもたらす18。最近、方法論的要約は、A. thalianaにV. longisporumまたはV. dahliaeを感染させるための異なる根接種戦略を提示し、実験セットアップの計画を支援した19。畑では、V. longisporumは時折油糧種子菜種生産に重大な損傷を与える12が、V. dahliaeはブドウ、ジャガイモ、トマトなどのいくつかの栽培種を含む非常に広い宿主範囲を有する8。これにより、両方の病原体を研究するのに経済的に興味深いモデルになります。
したがって、以下のプロトコルは、V. longisporum および V. dahliae の両方をモデル根病原体として使用して、根接種のための可能なアプローチを例示する。シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、油糧種子菜種(アブラナナプス)、およびトマト(Solanum lycopersicum)がモデル宿主として選択された。方法論の詳細な説明は、以下のテキストと付属のビデオで見つけることができます。各接種系の長所と短所について考察する。まとめると、このプロトコルコレクションは、根と微生物の相互作用の文脈における特定の研究課題に適した方法を特定するのに役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
土壌媒介性植物病原体1による収量損失が大きいため、農業戦略や作物品種の改善が求められています。土壌媒介性疾患の病因に関する限られた洞察は、より抵抗性の高い植物の発達を妨げる。根底にある病態メカニズムを探求する必要があり、そのためには堅牢な方法論的プラットフォームが必要である。報告された接種手順は、根−微生物相互作用における多因子事象が…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、これらの方法に関する以前の研究についてティム・イヴェンとジャクリーン・コモレク、この研究に必要な機器とリソースを提供したヴォルフガング・ドレーゲ・レーザー(ドイツ、ヴュルツブルク大学薬学部)、ヴォルフガング・ドレーゲ・レーザーとフィリップ・クライス(どちらもヴュルツブルク大学)のグループが原稿の批判的な校正を行ったことを認めている。この研究は「Deutsche Forschungsgemeinschaft」(DFG, DR273/15-1,2)の支援を受けた。
Materials
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | all systems described require Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software to determine leaf areas |
| Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer flask with four baffles |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth medium | Duchefa | C1714 | |
| Digital camera | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine gas |
| Fluorescence Microscope | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiumsulfate-Heptahydrate |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size ØxH: 92 × 16 mm |
| Plastic cups (500 mL, transparent) | Pro-pac, salad boxx | 5070 | size: 108 × 81 × 102 mm |
| Pleated cellulose filter | Hartenstein | FF12 | particle retention level 8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Potato Dextrose Broth medium | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Reaction tubes 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Rotary (orbital) shaker | Edmund Bühler | SM 30 C control | |
| Sand (bird sand) | Pet Bistro, Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q purified water) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
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