Isolement de cellules souches mésenchymateuses du tissu adipeux de rat pour la différenciation en cellules productrices d’insuline
Summary
Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (CSAd) peuvent être une source potentielle de CSM qui se différencient en cellules productrices d’insuline (IPC). Dans ce protocole, nous fournissons des étapes détaillées pour l’isolement et la caractérisation des Ad-MSC épididymiques de rat, suivies d’un protocole simple et court pour la génération d’IPC à partir des mêmes Ad-MSC de rat.
Abstract
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM), en particulier celles isolées du tissu adipeux (CSA) , ont fait l’objet d’une attention particulière en tant que source renouvelable et abondante de cellules souches qui ne pose aucun problème éthique. Cependant, les méthodes actuelles pour isoler les Ad-MSC ne sont pas normalisées et utilisent des protocoles compliqués qui nécessitent un équipement spécial. Nous avons isolé les CSAd de la graisse épididymale de rats Sprague-Dawley à l’aide d’une méthode simple et reproductible. Les Ad-MSC isolés apparaissent généralement dans les 3 jours suivant l’isolement, car les cellules adhérentes présentent une morphologie fibroblastique. Ces cellules atteignent 80% de confluence dans les 1 semaine suivant l’isolement. Par la suite, au passage 3-5 (P3-5), une caractérisation complète a été effectuée pour les CSA isolés par immunophénotypage des marqueurs de surface du groupe de différenciation (CD) MSC caractéristiques tels que CD90, CD73 et CD105, ainsi que par induction de la différenciation de ces cellules dans les lignées ostéogéniques, adipogènes et chondrogènes. Ceci, à son tour, implique la multipotence des cellules isolées. De plus, nous avons induit la différenciation des Ad-MSC isolés vers la lignée des cellules productrices d’insuline (IPC) via un protocole simple et relativement court en incorporant le milieu Eagle modifié de Dulbecco (HG-DMEM), le β-mercaptoéthanol, le nicotinamide et l’exendine-4. La différenciation des IPC a été évaluée génétiquement, tout d’abord, en mesurant les niveaux d’expression de marqueurs β cellulaires spécifiques tels que MafA, NKX6.1, Pdx-1 et Ins1, ainsi que la coloration à la dithizone pour les IPC générés. Deuxièmement, l’évaluation a également été réalisée fonctionnellement par un test de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS). En conclusion, les Ad-MSC peuvent être facilement isolés, présentant tous les critères de caractérisation des CSM, et ils peuvent en effet fournir une source abondante et renouvelable de PIC en laboratoire pour la recherche sur le diabète.
Introduction
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM), également connues sous le nom de cellules stromales mésenchymateuses, sont parmi les types de cellules les plus largement utilisés pour la médecine régénérative 1,2. Elles sont classées comme cellules souches adultes et caractérisées par un potentiel de différenciation multiligne et une capacité d’auto-renouvellement3. Les CSM peuvent être isolés et obtenus à partir de diverses sources, y compris le tissu adipeux, la moelle osseuse, le sang périphérique, le tissu et le sang du cordon ombilical, les follicules pileux et les dents 4,5.
L’isolement des cellules souches du tissu adipeux est considéré comme à la fois attrayant et prometteur en raison de leur accès facile, de leur expansion rapide in vitro et de leur rendement élevé6. Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (CSAd) peuvent être isolées de différentes espèces telles que les humains, les bovins, les souris, les rats et, plus récemment, les chèvres7. Il a été prouvé que les Ad-MSC sont maintenant des candidats potentiels pour l’ingénierie tissulaire et la thérapie génique / cellulaire qui peuvent même être utilisés pour développer une alternative autologue pour la réparation à long terme des lésions ou des défauts des tissus mous 7,8.
L’International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) a défini trois critères minimaux qui doivent être présentés par les MSC pour une caractérisation complète9. Tout d’abord, ils doivent être adhérents au plastique. Deuxièmement, les CSM devraient exprimer des marqueurs mésenchymateux de la surface des cellules souches tels que CD73, CD90 et CD105 et manquer d’expression des marqueurs hématopoïétiques CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79α ou CD19 et HLA-DR. Enfin, les CSM devraient présenter la capacité de se différencier en trois lignées mésenchymateuses: adipocytes, ostéocytes et chondrocytes. Fait intéressant, les CSM peuvent également se différencier en d’autres lignées telles que les cellules neuronales, les cardiomyocytes, les hépatocytes et les cellules épithéliales10,11.
En fait, les CSM possèdent des propriétés uniques qui leur permettent d’être appliquées en tant qu’agents thérapeutiques potentiels dans la thérapie régénérative pour différentes maladies. Les CSM peuvent sécréter des facteurs solubles pour induire un environnement immunomodulateur qui procure des avantages thérapeutiques12. En outre, les CSM peuvent migrer vers des sites de blessures et des microenvironnements tumoraux pour administrer un traitement ciblé; toutefois, les mécanismes ne sont pas entièrement élucidés13. En outre, les CSM ont la capacité de sécréter des exosomes, des vésicules extracellulaires à l’échelle nanométrique qui transportent une cargaison d’ARN non codants, de protéines et de facteurs solubles, qui ont récemment émergé comme un nouveau mécanisme du potentiel thérapeutique des CSM dans diverses maladies14.
Plus important encore, les CSM ont suscité une attention marquée pour leur potentiel à se différencier en cellules productrices d’insuline (IPC), soit par modification génétique15,16, soit en utilisant divers facteurs extrinsèques dans les milieux de culture in vitro17. La période d’induction de l’IPC varie considérablement, car elle dépend du protocole d’induction utilisé et des facteurs extrinsèques utilisés. Le processus de différenciation peut durer de quelques jours à plusieurs mois, et il nécessite une combinaison de facteurs exogènes qui doivent être ajoutés et / ou retirés à différentes étapes. Bon nombre de ces facteurs qui ont été utilisés pour la différenciation pancréatique endocrinienne sont des composés biologiquement actifs dont il a été démontré qu’ils favorisent la prolifération ou la différenciation/néogenèse des cellules β sécrétant de l’insuline et/ou augmentent la teneur en insuline des IPC 18,19,20,21. Il convient de noter ici que les CSM ont également été signalés pour avoir des effets thérapeutiques dans le diabète et ses complications via plusieurs mécanismes, y compris leur sécrétome, ainsi qu’un large éventail d’actions immunomodulatrices 22,23,24.
Dans ce protocole, nous présentons un protocole détaillé par étapes pour l’isolement et la caractérisation des CSAd à partir de graisse épididymale de rat, suivi d’un protocole simple et relativement court pour la génération de CPI à partir d’Ad-MSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous avons réussi à présenter un protocole détaillé pour l’isolement des Ad-MSC de la graisse épididymale de rat et la différenciation de ces Ad-MSC en IPC. En fait, la graisse épidydimale de rat est une source facilement accessible de tissu adipeux pour l’obtention d’Ad-MSC et ne nécessite aucun équipement spécial, ni pour la collecte ni pour le traitement 15,26,27. Les Ad-MSC isolés ont mon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Rawda Samir Mohamed, MSc, vétérinaire spécialiste, Faculté de pharmacie, Université britannique d’Égypte (BUE) pour son aide à la dissection des rats.
Nous tenons également à remercier et à apprécier les efforts de la Faculté de communication de masse de l’Université britannique en Égypte (BUE) pour la production et le montage de la vidéo de ce manuscrit.
Nous tenons à remercier Mlle Fatma Masoud, MSc, maître de conférences en anglais, The British University in Egypt (BUE) pour la révision et la relecture en anglais du manuscrit.
Ce travail a été partiellement financé par le Center for Drug Research and Development (CDRD), Faculté de pharmacie, Université britannique en Égypte (BUE), Le Caire, Égypte.
Materials
| Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
| Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM – High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM – Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
| Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
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