Isolatie van rat vetweefsel Mesenchymale stamcellen voor differentiatie in insulineproducerende cellen
Summary
Vetweefsel-afgeleide mesenchymale stamcellen (Ad-MSC’s) kunnen een potentiële bron zijn van MSC’s die differentiëren in insulineproducerende cellen (IPC’s). In dit protocol bieden we gedetailleerde stappen voor de isolatie en karakterisering van epididymale Ad-MSC’s bij ratten, gevolgd door een eenvoudig, kort protocol voor het genereren van IPC’s van dezelfde rat Ad-MSC’s.
Abstract
Mesenchymale stamcellen (MSC’s) – vooral die geïsoleerd uit vetweefsel (Ad-MSC’s) – hebben speciale aandacht gekregen als een hernieuwbare, overvloedige bron van stamcellen die geen ethische problemen oplevert. De huidige methoden om Ad-MSC’s te isoleren zijn echter niet gestandaardiseerd en maken gebruik van gecompliceerde protocollen waarvoor speciale apparatuur nodig is. We isoleerden Ad-MSC’s uit het epididymale vet van Sprague-Dawley-ratten met behulp van een eenvoudige, reproduceerbare methode. De geïsoleerde Ad-MSC’s verschijnen meestal binnen 3 dagen na isolatie, omdat adherente cellen fibroblastische morfologie vertonen. Die cellen bereiken 80% samenvloeiing binnen 1 week na isolatie. Daarna, bij passage 3-5 (P3-5), werd een volledige karakterisering uitgevoerd voor de geïsoleerde Ad-MSC’s door immunofenotypering voor karakteristieke MSC cluster van differentiatie (CD) oppervlaktemarkers zoals CD90, CD73 en CD105, evenals het induceren van differentiatie van deze cellen in de osteogene, adipogene en chondrogene afstammingslijnen. Dit impliceert op zijn beurt de multipotentie van de geïsoleerde cellen. Bovendien hebben we de differentiatie van de geïsoleerde Ad-MSC’s naar de insulineproducerende cellen (IPC’s) -afstamming geïnduceerd via een eenvoudig, relatief kort protocol door het gemodificeerde Eagle-medium (HG-DMEM) van hoge glucose Dulbecco op te nemen, β-mercaptoethanol, nicotinamide en exendin-4. IPC-differentiatie werd genetisch beoordeeld, ten eerste, door het meten van de expressieniveaus van specifieke β-cel markers zoals MafA, NKX6.1, Pdx-1 en Ins1, evenals dithizonkleuring voor de gegenereerde IPC’s. Ten tweede werd de beoordeling ook functioneel uitgevoerd door een glucose-gestimuleerde insulinesecretie (GSIS) assay. Kortom, Ad-MSC’s kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd, met alle MSC-karakteriseringscriteria, en ze kunnen inderdaad een overvloedige, hernieuwbare bron van IPC’s in het laboratorium bieden voor diabetesonderzoek.
Introduction
Mesenchymale stamcellen (MSC’s), ook bekend als mesenchymale stromale cellen, behoren tot de meest gebruikte celtypen voor regeneratieve geneeskunde 1,2. Ze worden geclassificeerd als volwassen stamcellen en gekenmerkt door multilineaire differentiatiepotentieel en zelfvernieuwingscapaciteit3. MSC’s kunnen worden geïsoleerd en verkregen uit verschillende bronnen, waaronder vetweefsel, beenmerg, perifeer bloed, navelstrengweefsel en bloed, haarzakjes en tanden 4,5.
De isolatie van stamcellen uit vetweefsel wordt gezien als zowel aantrekkelijk als veelbelovend vanwege hun gemakkelijke toegang, snelle expansie in vitro en hoge opbrengst6. Vetweefsel-afgeleide mesenchymale stamcellen (Ad-MSC’s) kunnen worden geïsoleerd van verschillende soorten zoals mensen, runderen, muizen, ratten en, meer recent, geiten7. Het is bewezen dat Ad-MSC’s nu potentiële kandidaten zijn voor tissue engineering en gen/celtherapie die zelfs kunnen worden gebruikt om een autoloog alternatief te ontwikkelen voor het langdurig herstel van wekedelenletsel of defecten 7,8.
De International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) heeft drie minimumcriteria gedefinieerd die door MSC’s moeten worden tentoongesteld voor volledige karakterisering9. Ten eerste moeten ze plastic hechten. Ten tweede moeten MSC’s mesenchymale stamceloppervlakmarkers zoals CD73, CD90 en CD105 tot expressie brengen en de expressie van de hematopoëtische markers CD45, CD34, CD14 of CD11b, CD79α of CD19 en HLA-DR missen. Ten slotte moeten MSC’s het vermogen vertonen om te differentiëren in de drie mesenchymale afstammingslijnen: adipocyten, osteocyten en chondrocyten. Interessant is dat MSC’s ook kunnen differentiëren in andere afstammingslijnen zoals neuronale cellen, cardiomyocyten, hepatocyten en epitheelcellen10,11.
In feite bezitten MSC’s unieke eigenschappen die het mogelijk maken om ze toe te passen als potentiële therapeutische middelen in regeneratieve therapie voor verschillende ziekten. MSC’s kunnen oplosbare factoren afscheiden om een immunomodulerende omgeving te induceren die therapeutische voordelen biedt12. Bovendien kunnen MSC’s migreren naar plaatsen van letsel en tumormicro-omgevingen om gerichte therapie te leveren; de mechanismen zijn echter niet volledig opgehelderd13. Bovendien hebben MSC’s de mogelijkheid om exosomen, extracellulaire blaasjes op nanoschaal die een lading niet-coderende RNA’s, eiwitten en oplosbare factoren dragen, uit te scheiden, die onlangs naar voren kwamen als een nieuw mechanisme van het therapeutische potentieel van de MSC’s bij verschillende ziekten14.
Wat nog belangrijker is, msc’s hebben duidelijke aandacht gegenereerd voor hun potentieel om te differentiëren in insulineproducerende cellen (IPC’s), hetzij door genetische modificatie15,16 of door gebruik te maken van verschillende extrinsieke inducerende factoren binnen de kweekmedia in vitro17. De IPC-inductieperiode varieert sterk, omdat deze afhankelijk is van het gebruikte inductieprotocol en de gebruikte extrinsieke factoren. Het proces van differentiatie kan dagen tot maanden duren en vereist een combinatie van exogene inducerende factoren die in verschillende stadia moeten worden toegevoegd en / of ingetrokken. Veel van deze factoren die zijn gebruikt voor endocriene pancreasdifferentiatie zijn biologisch actieve verbindingen waarvan is aangetoond dat ze de proliferatie of differentiatie / neogenese van insuline-afscheidende β-cellen bevorderen en / of het insulinegehalte van IPC’s verhogen 18,19,20,21. Het is hier opmerkelijk dat MSC’s ook zijn gemeld met therapeutische effecten bij diabetes en de complicaties ervan via verschillende mechanismen, waaronder hun secretoom, evenals een breed scala aan immunomodulerende acties 22,23,24.
In dit protocol presenteren we een gedetailleerd stapsgewijs protocol voor de isolatie en karakterisering van Ad-MSC’s van rattenepitheel vet, gevolgd door een eenvoudig, relatief kort protocol voor het genereren van IPC’s van Ad-MSC’s.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol zijn we erin geslaagd om een gedetailleerd protocol te presenteren voor de isolatie van Ad-MSC’s van rattenepidemaal vet en de differentiatie van deze Ad-MSC’s in IPC’s. In feite is epidydimaal vet van ratten een gemakkelijk bereikbare bron van vetweefsel voor het verkrijgen van Ad-MSC’s en is er geen speciale apparatuur nodig, noch voor verzameling noch voor het verwerken van 15,26,27. De geïsoleerde Ad-MSC’s v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, Dierenarts Specialist, Faculteit Farmacie, De Britse Universiteit van Egypte (BUE) voor het helpen met de dissectie van de ratten.
We willen ook de inspanningen van de Faculteit massacommunicatie, de Britse Universiteit in Egypte (BUE) voor de productie en bewerking van de video van dit manuscript erkennen en waarderen.
We willen graag Miss Fatma Masoud, MSc, Assistant Lecturer of English, The British University in Egypt (BUE) bedanken voor de revisie en het proeflezen in de Engelse taal van het manuscript.
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door het Center for Drug Research and Development (CDRD), Faculteit Farmacie, De Britse Universiteit in Egypte (BUE), Caïro, Egypte.
Materials
| Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
| Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM – High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM – Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
| Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
References
- Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).
- Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine. Handbook of Stem Cell Therapy. , 1-28 (2022).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- De Ugarte, D. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user’s guide. Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Camara, B. O. S., et al. Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).
- Ren, Y., et al. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).
- Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
- Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells International. 2016, 6737345 (2016).
- Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236 (2020).
- Karp, J., Leng Teo, G. Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details. Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).
- Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Lopez, M. J., Spencer, N. D. In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation. Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).
- Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Lee, R. H., et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).
- Gao, L. R., et al. Overexpression of apelin in Wharton’s jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic β cell proliferation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 339 (2018).
- Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Research & Therapy. 7, 108 (2016).
- Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).
- Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).
- Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).
- Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of flow cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , 1-12 (2010).
- Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).
- Qi, Y., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 277 (2021).
- Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 8 (2), 2652 (2020).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).
- Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).
- Gabr, M. M., et al. From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells. BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).
- Xin, Y., et al. Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia. PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 484 (2020).
- El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. A comparison of Wharton’s jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
- El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).
- Gabr, M. M., et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study. Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).
