Sıçan Yağ Dokusu Mezenkimal Kök Hücrelerinin İnsülin Üreten Hücrelere Farklılaşması İçin İzolasyonu
Summary
Yağ dokusundan türetilmiş mezenkimal kök hücreler (Ad-MSC’ler), insülin üreten hücrelere (IPC’ler) farklılaşan potansiyel bir MSC kaynağı olabilir. Bu protokolde, sıçan epididim Ad-MSC’lerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı adımlar ve ardından aynı sıçan Ad-MSC’lerinden IPC’lerin üretilmesi için basit, kısa bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Mezenkimal kök hücreler (MSC’ler) – özellikle yağ dokusundan izole edilenler (Ad-MSC’ler) – herhangi bir etik kaygı oluşturmayan yenilenebilir, bol miktarda kök hücre kaynağı olarak özel ilgi görmüştür. Bununla birlikte, Ad-MSC’leri izole etmek için mevcut yöntemler standartlaştırılmamıştır ve özel ekipman gerektiren karmaşık protokoller kullanmaktadır. Ad-MSC’leri Sprague-Dawley sıçanlarının epididim yağından basit, tekrarlanabilir bir yöntem kullanarak izole ettik. İzole Ad-MSC’ler genellikle izolasyondan sonraki 3 gün içinde ortaya çıkar, çünkü yapışkan hücreler fibroblastik morfoloji gösterir. Bu hücreler izolasyondan sonraki 1 hafta içinde% 80 akıcılığa ulaşır. Daha sonra, pasaj 3-5’te (P3-5), CD90, CD73 ve CD105 gibi karakteristik MSC farklılaşma (CD) yüzey belirteçleri kümesi için immünofenotipleme yapılarak izole Ad-MSC’ler için tam bir karakterizasyon gerçekleştirildi ve bu hücrelerin osteojenik, adipojenik ve kondrojenik soylardan farklılaşması indüklendi. Bu da, izole edilmiş hücrelerin çok potansiyelli olduğunu ima eder. Ayrıca, izole Ad-MSC’lerin insülin üreten hücrelere (IPC’ler) doğru farklılaşmasını, yüksek glikozlu Dulbecco’nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (HG-DMEM), β-merkaptoetanol, nikotinamid ve eksendin-4’ü dahil ederek basit, nispeten kısa bir protokol yoluyla indükledik. IPC’lerin farklılaşması, ilk olarak, MafA, NKX6.1, Pdx-1 ve Ins1 gibi spesifik β hücre belirteçlerinin ekspresyon seviyelerinin yanı sıra üretilen IPC’ler için ditizon boyaması yoluyla genetik olarak değerlendirildi. İkincisi, değerlendirme fonksiyonel olarak glukoz ile uyarılmış insülin sekresyonu (GSIS) testi ile gerçekleştirildi. Sonuç olarak, Ad-MSC’ler tüm MSC karakterizasyon kriterlerini sergileyerek kolayca izole edilebilir ve diyabet araştırması için laboratuarda bol, yenilenebilir bir IPC kaynağı sağlayabilirler.
Introduction
Mezenkimal stromal hücreler olarak da bilinen mezenkimal kök hücreler (MSC’ler), rejeneratif tıp için en yaygın kullanılan hücre tipleri arasındadır 1,2. Yetişkin kök hücreler olarak sınıflandırılırlar ve çok soylu farklılaşma potansiyeli ve kendini yenileme kapasitesi3 ile karakterize edilirler. MSC’ler izole edilebilir ve yağ dokusu, kemik iliği, periferik kan, göbek kordonu dokusu ve kan, saç kökleri ve dişler dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan elde edilebilir 4,5.
Kök hücrelerin yağ dokusundan izole edilmesi, kolay erişim, in vitro hızlı genişleme ve yüksek verim6 nedeniyle hem çekici hem de umut verici olarak görülmektedir. Yağ dokusundan türetilen mezenkimal kök hücreler (Ad-MSC’ler) insanlar, sığırlar, fareler, sıçanlar ve daha yakın zamanda keçiler gibi farklı türlerden izole edilebilir7. Ad-MSC’lerin artık doku mühendisliği ve gen/hücre tedavisi için potansiyel adaylar olduğu ve yumuşak doku hasarı veya defektlerinin uzun süreli onarımı için otolog bir alternatif geliştirmek için bile kullanılabileceği kanıtlanmıştır 7,8.
Uluslararası Hücre ve Gen Terapisi Derneği (ISCT), tam karakterizasyon için MSC’ler tarafından sergilenmesi gereken üç minimum kriter tanımlamıştır9. İlk olarak, plastik yapışkan olmalıdırlar. İkincisi, MSC’ler CD73, CD90 ve CD105 gibi mezenkimal kök hücre yüzey belirteçlerini eksprese etmeli ve hematopoetik belirteçler CD45, CD34, CD14 veya CD11b, CD79α veya CD19 ve HLA-DR’nin ekspresyonundan yoksundur. Son olarak, MSC’ler üç mezenkimal soya farklılaşma yeteneğini sergilemelidir: adipositler, osteositler ve kondrositler. İlginç bir şekilde, MSC’ler nöronal hücreler, kardiyomiyositler, hepatositler ve epitel hücreleri10,11 gibi diğer soylara da farklılaşabilir.
Aslında, MSC’ler, farklı hastalıklar için rejeneratif tedavide potansiyel terapötik ajanlar olarak uygulanmalarını sağlayan benzersiz özelliklere sahiptir. MSC’ler, terapötik faydalar sağlayan immünomodülatör bir ortamı indüklemek için çözünür faktörleri salgılayabilir12. Ek olarak, MSC’ler hedefe yönelik tedavi sunmak için yaralanma bölgelerine ve tümör mikro ortamlarına doğru göç edebilir; ancak, mekanizmalar tam olarak aydınlatılamamıştır13. Ek olarak, MSC’ler, son zamanlarda MSC’lerin çeşitli hastalıklardaki terapötik potansiyelinin yeni bir mekanizması olarak ortaya çıkan kodlanmamış RNA’lar, protein ve çözünür faktörlerden oluşan bir kargo taşıyan nano ölçekte eksozomları, hücre dışı vezikülleri salgılama yeteneğine sahiptir14.
Daha da önemlisi, MSC’ler, genetik modifikasyon 15,16 veya in vitro 17 kültür ortamında çeşitli dışsal indükleyici faktörler kullanarak, insülin üreten hücrelere (IPC’ler) farklılaşma potansiyelleri için belirgin bir dikkat çekmiştir. IPC indüksiyon periyodu, kullanılan indüksiyon protokolüne ve kullanılan dışsal faktörlere bağlı olduğu için büyük ölçüde değişir. Farklılaşma süreci günlerden aylara kadar sürebilir ve farklı aşamalarda eklenmesi ve / veya geri çekilmesi gereken eksojen indükleyici faktörlerin bir kombinasyonunu gerektirir. Endokrin pankreas farklılaşması için kullanılan bu faktörlerin çoğu, insülin salgılayan β hücrelerinin proliferasyonunu veya farklılaşmasını / neogenezini teşvik ettiği ve / veya IPC’lerin insülin içeriğini arttırdığı gösterilen biyolojik olarak aktif bileşiklerdir 18,19,20,21. Burada, MSC’lerin diyabette ve komplikasyonlarında, sekretomları da dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalar yoluyla terapötik etkilere ve ayrıca çok çeşitli immüno-modülatör etkilere sahip oldukları bildirilmiştir22,23,24.
Bu protokolde, Ad-MSC’lerin sıçan epididim yağından izolasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı bir aşamalı protokol ve ardından Ad-MSC’lerden IPC’lerin üretilmesi için basit, nispeten kısa bir protokol sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, Ad-MSC’lerin sıçan epididim yağından izolasyonu ve bu Ad-MSC’lerin IPC’lere farklılaşması için ayrıntılı bir protokol sunmayı başardık. Aslında, sıçan epididim yağı, Ad-MSC’leri elde etmek için kolayca elde edilebilir bir yağ dokusu kaynağıdır ve ne toplamane de işleme için herhangi bir özel ekipman gerektirmez 15,26,27. İzole edilmiş Ad-MSC’ler mükemmel kültür genişlemesi gösterd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, Veteriner Uzmanı, Eczacılık Fakültesi, Mısır İngiliz Üniversitesi (BUE) sıçanların diseksiyonuna yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.
Ayrıca, Mısır’daki İngiliz Üniversitesi (BUE) Kitle İletişim Fakültesi’nin bu el yazmasının videosunun üretimi ve düzenlenmesi için gösterdiği çabaları kabul etmek ve takdir etmek isteriz.
Makalenin revizyonu ve İngilizce dilinde düzeltilmesi için Mısır’daki İngiliz Üniversitesi (BUE) İngilizce Öğretim Görevlisi Yüksek Lisans Öğrencisi Bayan Fatma Masoud’a teşekkür ederiz.
Bu çalışma kısmen İlaç Araştırma ve Geliştirme Merkezi (CDRD), Eczacılık Fakültesi, Mısır’daki İngiliz Üniversitesi (BUE), Kahire, Mısır tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Albumin, bovine serum Fraction V | MP Biomedicals | ||
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich, USA | A3157 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich, USA | A5533 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific, Germany | ||
| Antibody for Rat CD90, FITC | Stem Cell Technologies | 60024FI | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3912 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| CD105 Monoclonal Antibody, FITC | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | MA1-19594 | |
| CD34 Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA | PA5-85917 | |
| Chloroform | Fisher Scientific, USA | ||
| Collagenase type I, powder | Gibco, Thermo Fisher, USA | 17018029 | |
| D-Glucose anhydrous, extra pure | Fisher Scientific, Germany | G/0450/53 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific, Germany | BP231-100 | |
| Dithizone staining | Sigma-Aldrich, USA | D5130 | |
| DMEM – High Glucose 4.5 g/L | Lonza, Switzerland | 12-604F | |
| DMEM – Low Glucose 1 g/L | Lonza, Switzerland | 12-707F | |
| DMEM/F12 medium | Lonza, Switzerland | BE12-719F | |
| DNAse/RNAse free water | Gibco Thermo Fisher, USA | 10977-035 | |
| Ethanol absolute, Molecular biology grade | Sigma-Aldrich, Germany | 24103 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich, Germany | E7144 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Thermo Fisher, Brazil | 10270-106 | |
| Formaldehyde 37% | Fisher Scientific | ||
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Isopropanol, Molecular biology grade | Fisher Scientific, USA | BP2618500 | |
| L-Glutamine | Gibco Thermo Fisher, USA | 25030-024 | |
| Magnesium Chloride (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit | R&D systems Inc., MN, USA | SC006 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich, Germany | N0636 | |
| Oil Red Stain | Sigma-Aldrich, USA | O0625 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin | Gibco Thermo Fisher, USA | 15240062 | |
| Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg | Lonza, Switzerland | BE17-516F | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Rat Insulin ELISA Kit | Cloud-Clone Corp., USA | CEA682Ra | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Chloride | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous) | Fisher Scientific, Germany | ||
| SYBR Green Maxima | Thermo Scientific, USA | K0221 | |
| Syringe filter, 0.2 micron | Corning, USA | 431224 | |
| TRIzol | Thermo Scientific, USA | 15596026 | |
| Trypan blue | Gibco Thermo Fisher, USA | 15250061 | |
| Trypsin-Versene-EDTA, 1X | Lonza, Switzerland | CC-5012 | |
| Verso cDNA synthesis kit | Thermo Scientific, USA | AB-1453/A | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Germany | M3148 |
References
- Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).
- Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine. Handbook of Stem Cell Therapy. , 1-28 (2022).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- De Ugarte, D. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).
- Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user’s guide. Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).
- Camara, B. O. S., et al. Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).
- Ren, Y., et al. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).
- Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
- Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells International. 2016, 6737345 (2016).
- Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236 (2020).
- Karp, J., Leng Teo, G. Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details. Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).
- Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Lopez, M. J., Spencer, N. D. In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation. Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).
- Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).
- Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
- Lee, R. H., et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).
- Gao, L. R., et al. Overexpression of apelin in Wharton’s jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic β cell proliferation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 339 (2018).
- Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Research & Therapy. 7, 108 (2016).
- Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).
- Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).
- Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).
- Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of flow cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , 1-12 (2010).
- Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).
- Qi, Y., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 277 (2021).
- Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 8 (2), 2652 (2020).
- Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
- Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).
- Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).
- Gabr, M. M., et al. From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells. BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).
- Xin, Y., et al. Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia. PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 484 (2020).
- El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. A comparison of Wharton’s jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).
- Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
- El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton’s jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).
- Gabr, M. M., et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study. Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).
