Investigación espectrométrica de masas multifacética de neuropéptidos en Callinectes sapidus

El sistema nervioso es complejo y requiere una red de neuronas para transmitir señales a través de un organismo. El sistema nervioso coordina la información sensorial y la respuesta biológica. Las interacciones intrincadas y enrevesadas involucradas en la transmisión de señales requieren muchas moléculas de señalización diferentes, como neurotransmisores, esteroides y neuropéptidos. Como los neuropéptidos son las moléculas de señalización más diversas y potentes que desempeñan un papel clave en la activación de las respuestas fisiológicas al estrés y otros estímulos, es de interés determinar su papel específico en estos procesos fisiológicos. La función neuropeptídica está relacionada con su estructura de aminoácidos, que determina la movilidad, la interacción del receptor y la afinidad¹. Técnicas como la histoquímica, que es importante porque los neuropéptidos se pueden sintetizar, almacenar y liberar en diferentes regiones del tejido, y la electrofisiología se han empleado para investigar la estructura y función de los neuropéptidos ^2,3,4, pero estos métodos están limitados por el rendimiento y la especificidad para resolver la vasta diversidad de secuencias de los neuropéptidos.

La espectrometría de masas (EM) permite el análisis de alto rendimiento de la estructura y abundancia de neuropéptidos. Esto se puede realizar a través de diferentes técnicas de EM, más comúnmente cromatografía líquida-ionización electrospray MS (LC-ESI-MS)⁵ y MS de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-MS)⁶. Utilizando mediciones de masa de alta precisión y fragmentación de EM, la EM proporciona la capacidad de asignar la secuencia de aminoácidos y el estado de modificación post-traduccional (PTM) a neuropéptidos de mezclas complejas sin conocimiento a priori para ayudar a determinar su función ^7,8. Además de la información cualitativa, la EM permite la información cuantitativa de neuropéptidos a través de la cuantificación sin etiquetas (LFQ) o métodos basados en etiquetas, como el etiquetado isotópico o isobárico⁹. Las principales ventajas de LFQ incluyen su simplicidad, bajo costo de análisis y disminución de los pasos de preparación de la muestra que pueden minimizar la pérdida de muestras. Sin embargo, las desventajas de LFQ incluyen un aumento de los costos de tiempo del instrumento, ya que requiere múltiples réplicas técnicas para abordar el error cuantitativo de la variabilidad de ejecución a ejecución. Esto también conduce a una disminución de la capacidad de cuantificar con precisión pequeñas variaciones. Los métodos basados en etiquetas se someten a una variación menos sistemática, ya que múltiples muestras pueden etiquetarse diferencialmente utilizando una variedad de isótopos estables, combinados en una muestra y analizados a través de espectrometría de masas simultáneamente. Esto también aumenta el rendimiento, aunque las etiquetas isotópicas pueden llevar mucho tiempo y ser costosas de sintetizar o comprar. La complejidad espectral de los espectros de masas de exploración completa (MS1) también aumenta a medida que aumenta la multiplexación, lo que disminuye el número de neuropéptidos únicos capaces de fragmentarse y, por lo tanto, identificarse. Por el contrario, el etiquetado isobárico no aumenta la complejidad espectral a nivel de MS1, aunque introduce desafíos para los analitos de baja abundancia, como los neuropéptidos. Como la cuantificación isobárica se realiza a nivel de espectros de masas de iones de fragmento (MS2), los neuropéptidos de baja abundancia pueden no poder cuantificarse, ya que se pueden seleccionar componentes de matriz más abundantes para la fragmentación y los seleccionados pueden no tener una abundancia lo suficientemente alta como para ser cuantificados. Con el etiquetado isotópico, la cuantificación se puede realizar en cada péptido identificado.

Además de la identificación y cuantificación, la información de localización puede ser obtenida por MS a través de imágenes MALDI-MS (MALDI-MSI)¹⁰. Al rasterizar un láser a través de una superficie de muestra, los espectros MS se pueden compilar en una imagen de mapa de calor para cada valor m / z . El mapeo de la intensidad de la señal neuropeptídica transitoria en diferentes regiones a través de las condiciones puede proporcionar información valiosa para la determinación de la función¹¹. La localización de neuropéptidos es especialmente importante porque la función del neuropéptido puede diferir dependiendo de la ubicación¹².

Los neuropéptidos se encuentran en menor abundancia in vivo que otras moléculas de señalización, como los neurotransmisores, y por lo tanto requieren métodos sensibles para la detección¹³. Esto se puede lograr mediante la eliminación de componentes de la matriz de mayor abundancia, como los lípidos^11,14. Es necesario realizar consideraciones adicionales para el análisis de neuropéptidos en comparación con los flujos de trabajo proteómicos comunes, principalmente porque la mayoría de los análisis neuropeptidómicos omiten la digestión enzimática. Esto limita las opciones de software para el análisis de datos de neuropéptidos, ya que la mayoría se construyeron con algoritmos basados en datos de proteómica y coincidencias de proteínas informadas por la detección de péptidos. Sin embargo, muchos programas como PEAKS¹⁵ son más adecuados para el análisis de neuropéptidos debido a sus capacidades de secuenciación de novo. Se deben considerar varios factores para el análisis de neuropéptidos desde el método de extracción hasta el análisis de datos de EM.

Los protocolos descritos aquí incluyen métodos para la preparación de muestras y el etiquetado isotópico de dimetilo, adquisición de datos y análisis de datos de neuropéptidos por LC-ESI-MS, MALDI-MS y MALDI-MSI. A través de resultados representativos de varios experimentos, se demuestra la utilidad y la capacidad de estos métodos para identificar, cuantificar y localizar neuropéptidos de cangrejos azules, Callinectes sapidus. Para comprender mejor el sistema nervioso, los sistemas modelo se utilizan comúnmente. Muchos organismos no tienen un genoma completamente secuenciado disponible, lo que impide el descubrimiento integral de neuropéptidos a nivel de péptidos. Con el fin de mitigar este desafío, se incluye un protocolo para la identificación de nuevos neuropéptidos y la minería de transcriptomas para generar bases de datos para organismos sin información completa del genoma. Todos los protocolos presentados aquí pueden optimizarse para muestras de neuropéptidos de cualquier especie, así como aplicarse para el análisis de cualquier péptido endógeno.