Многогранное масс-спектрометрическое исследование нейропептидов в Callinectes sapidus

Нервная система сложна и требует сети нейронов для передачи сигналов по всему организму. Нервная система координирует сенсорную информацию и биологическую реакцию. Сложные и запутанные взаимодействия, участвующие в передаче сигнала, требуют множества различных сигнальных молекул, таких как нейротрансмиттеры, стероиды и нейропептиды. Поскольку нейропептиды являются наиболее разнообразными и мощными сигнальными молекулами, которые играют ключевую роль в активации физиологических реакций на стресс и другие раздражители, интересно определить их конкретную роль в этих физиологических процессах. Нейропептидная функция связана с их аминокислотной структурой, которая определяет подвижность, рецепторное взаимодействие и сродство¹. Такие методы, как гистохимия, которая важна, потому что нейропептиды могут синтезироваться, храниться и высвобождаться в разных областях ткани, и электрофизиология были использованы для исследования структуры и функции нейропептидов ^2,3,4, но эти методы ограничены пропускной способностью и специфичностью для разрешения огромного разнообразия последовательностей нейропептидов.

Масс-спектрометрия (МС) позволяет проводить высокопроизводительный анализ структуры и плотности нейропептидов. Это может быть выполнено с помощью различных методов МС, чаще всего жидкостной хроматографии-электрораспылительной ионизации MS (LC-ESI-MS)⁵ и матричной лазерной десорбции / ионизации MS (MALDI-MS)⁶. Используя высокоточные измерения массы и фрагментацию РС, МС обеспечивает возможность присваивать нейропептидам из сложных смесей статус последовательности аминокислот и посттрансляционной модификации (ПТМ) без априорных знаний, чтобы помочь в определении их функции ^7,8. В дополнение к качественной информации, MS позволяет получать количественную информацию о нейропептидах с помощью количественного определения без меток (LFQ) или методов на основе этикеток, таких как изотопная или изобарическая маркировка⁹. Основные преимущества LFQ включают в себя его простоту, низкую стоимость анализа и снижение этапов подготовки образцов, что может минимизировать потери образца. Тем не менее, недостатки LFQ включают в себя увеличение затрат времени прибора, поскольку он требует нескольких технических реплик для устранения количественной ошибки от вариативности от запуска к запуску. Это также приводит к снижению способности точно количественно оценивать небольшие вариации. Методы на основе этикеток подвергаются менее систематическому изменению, поскольку несколько образцов могут быть дифференциально маркированы с использованием различных стабильных изотопов, объединены в один образец и проанализированы с помощью масс-спектрометрии одновременно. Это также увеличивает пропускную способность, хотя изотопные этикетки могут быть трудоемкими и дорогостоящими для синтеза или покупки. Спектральная сложность масс-спектров полного сканирования (MS1) также увеличивается по мере увеличения мультиплексирования, что уменьшает количество уникальных нейропептидов, которые могут быть фрагментированы и, следовательно, идентифицированы. И наоборот, изобарическая маркировка не увеличивает спектральную сложность на уровне MS1, хотя и создает проблемы для аналитов с низким содержанием, таких как нейропептиды. Поскольку изобарическое количественное определение выполняется на уровне масс-спектров фрагментов ионов (MS2), нейропептиды с низким содержанием могут быть не в состоянии быть количественно определены, поскольку для фрагментации могут быть выбраны более обильные компоненты матрицы, а выбранные могут не иметь достаточно высокого содержания для количественной оценки. С помощью изотопной маркировки количественное определение может быть выполнено для каждого идентифицированного пептида.

В дополнение к идентификации и количественной оценке, информация о локализации может быть получена РС с помощью визуализации MALDI-MS (MALDI-MSI)¹⁰. Растрируя лазер по поверхности образца, ms-спектры могут быть скомпилированы в изображение тепловой карты для каждого значения m/z . Картирование интенсивности переходного нейропептидного сигнала в различных регионах в разных условиях может предоставить ценную информацию для определения функции¹¹. Локализация нейропептидов особенно важна, поскольку функция нейропептидов может отличаться в зависимости от местоположения¹².

Нейропептиды встречаются в меньшем количестве in vivo, чем другие сигнальные молекулы, такие как нейротрансмиттеры, и, таким образом, требуют чувствительных методов для обнаружения¹³. Это может быть достигнуто путем удаления компонентов матрицы с более высоким содержанием, таких как липиды^11,14. Дополнительные соображения для анализа нейропептидов должны быть сделаны по сравнению с обычными рабочими процессами протеомики, главным образом потому, что большинство нейропептидомных анализов опускают ферментативное пищеварение. Это ограничивает программные возможности для анализа данных нейропептидов, поскольку большинство из них были построены с помощью алгоритмов, основанных на данных протеомики и совпадениях белков, основанных на обнаружении пептидов. Тем не менее, многие программы, такие как PEAKS¹⁵, больше подходят для анализа нейропептидов из-за их возможностей секвенирования de novo. Для анализа нейропептидов необходимо учитывать несколько факторов, начиная от метода экстракции до анализа данных РС.

Протоколы, описанные здесь, включают методы пробоподготовки и диметилизотопной маркировки, сбора данных и анализа данных нейропептидов LC-ESI-MS, MALDI-MS и MALDI-MSI. С помощью репрезентативных результатов нескольких экспериментов демонстрируется полезность и способность этих методов идентифицировать, количественно оценивать и локализовать нейропептиды синих крабов, Callinectes sapidus. Чтобы лучше понять нервную систему, обычно используются модельные системы. Многие организмы не имеют полностью секвенированного генома, что препятствует всестороннему открытию нейропептидов на пептидном уровне. Чтобы смягчить эту проблему, включен протокол для идентификации новых нейропептидов и анализа транскриптомов для создания баз данных для организмов без полной информации о геноме. Все представленные здесь протоколы могут быть оптимизированы для нейропептидных образцов из любых видов, а также применены для анализа любых эндогенных пептидов.