Veelzijdig massaspectrometrisch onderzoek van neuropeptiden in Callinectes sapidus
Summary
Massaspectrometrische karakterisering van neuropeptiden biedt sequentie-, kwantificerings- en lokalisatie-informatie. Deze geoptimaliseerde workflow is niet alleen nuttig voor neuropeptidestudies, maar ook voor andere endogene peptiden. De protocollen die hier worden verstrekt, beschrijven monstervoorbereiding, MS-acquisitie, MS-analyse en databasegeneratie van neuropeptiden met behulp van LC-ESI-MS, MALDI-MS-spotting en MALDI-MS-beeldvorming.
Abstract
Neuropeptiden zijn signaalmoleculen die bijna alle fysiologische en gedragsprocessen reguleren, zoals ontwikkeling, reproductie, voedselinname en reactie op externe stressoren. Toch blijven de biochemische mechanismen en volledige aanvulling van neuropeptiden en hun functionele rollen slecht begrepen. De karakterisering van deze endogene peptiden wordt belemmerd door de immense diversiteit binnen deze klasse van signaalmoleculen. Bovendien zijn neuropeptiden bioactief bij concentraties die 100x – 1000x lager zijn dan die van neurotransmitters en zijn ze vatbaar voor enzymatische afbraak na synaptische afgifte. Massaspectrometrie (MS) is een zeer gevoelig analytisch hulpmiddel dat analyten kan identificeren, kwantificeren en lokaliseren zonder uitgebreide a priori kennis. Het is zeer geschikt voor het wereldwijd profileren van neuropeptiden en het helpen bij de ontdekking van nieuwe peptiden. Vanwege de lage abundantie en hoge chemische diversiteit van deze klasse van peptiden, zijn verschillende monstervoorbereidingsmethoden, MS-acquisitieparameters en data-analysestrategieën aangepast van proteomics-technieken om optimale neuropeptidekarakterisering mogelijk te maken. Hier worden methoden beschreven voor het isoleren van neuropeptiden uit complexe biologische weefsels voor sequentiekarakterisering, kwantificering en lokalisatie met behulp van vloeistofchromatografie (LC) -MS en matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) – MS. Een protocol voor het voorbereiden van een neuropeptide database van de blauwe krab, Callinectes sapidus, een organisme zonder uitgebreide genomische informatie, is opgenomen. Deze workflows kunnen worden aangepast om andere klassen van endogene peptiden in verschillende soorten te bestuderen met behulp van een verscheidenheid aan instrumenten.
Introduction
Het zenuwstelsel is complex en vereist een netwerk van neuronen om signalen door een organisme te verzenden. Het zenuwstelsel coördineert sensorische informatie en biologische respons. De ingewikkelde en ingewikkelde interacties die betrokken zijn bij signaaloverdracht vereisen veel verschillende signaalmoleculen zoals neurotransmitters, steroïden en neuropeptiden. Omdat neuropeptiden de meest diverse en krachtige signaalmoleculen zijn die een sleutelrol spelen bij het activeren van fysiologische reacties op stress en andere stimuli, is het van belang om hun specifieke rol in deze fysiologische processen te bepalen. Neuropeptidefunctie is gerelateerd aan hun aminozuurstructuur, die mobiliteit, receptorinteractie en affiniteit bepaalt1. Technieken zoals histochemie, wat belangrijk is omdat neuropeptiden kunnen worden gesynthetiseerd, opgeslagen en vrijgegeven in verschillende regio’s van het weefsel, en elektrofysiologie zijn gebruikt om neuropeptidestructuur en -functie 2,3,4 te onderzoeken, maar deze methoden worden beperkt door doorvoer en specificiteit om de enorme sequentiediversiteit van neuropeptiden op te lossen.
Massaspectrometrie (MS) maakt de high throughput analyse van neuropeptide structuur en abundantie mogelijk. Dit kan worden uitgevoerd door middel van verschillende MS-technieken, meestal vloeistofchromatografie-elektrospray-ionisatie MS (LC-ESI-MS)5 en matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie MS (MALDI-MS)6. Met behulp van zeer nauwkeurige massametingen en MS-fragmentatie biedt MS de mogelijkheid om aminozuursequentie en posttranslationele modificatie (PTM) status toe te wijzen aan neuropeptiden uit complexe mengsels zonder a priori kennis om te helpen bij het vaststellen van hun functie 7,8. Naast kwalitatieve informatie maakt MS kwantitatieve informatie van neuropeptiden mogelijk door middel van labelvrije kwantificering (LFQ) of labelgebaseerde methoden zoals isotopische of isobare etikettering9. De belangrijkste voordelen van LFQ zijn de eenvoud, lage analysekosten en verminderde monstervoorbereidingsstappen die monsterverlies kunnen minimaliseren. De nadelen van LFQ omvatten echter hogere instrumenttijdkosten, omdat het meerdere technische replicaties vereist om kwantitatieve fouten van run-to-run variabiliteit aan te pakken. Dit leidt ook tot een verminderd vermogen om kleine variaties nauwkeurig te kwantificeren. Labelgebaseerde methoden worden onderworpen aan minder systematische variatie omdat meerdere monsters differentieel kunnen worden gelabeld met behulp van een verscheidenheid aan stabiele isotopen, gecombineerd in één monster en tegelijkertijd geanalyseerd door massaspectrometrie. Dit verhoogt ook de doorvoer, hoewel isotopische etiketten tijdrovend en kostbaar kunnen zijn om te synthetiseren of te kopen. De spectrale complexiteit van full scan mass spectra (MS1) neemt ook toe naarmate multiplexing toeneemt, waardoor het aantal unieke neuropeptiden dat kan worden gefragmenteerd en daarom kan worden geïdentificeerd, afneemt. Omgekeerd verhoogt isobare etikettering de spectrale complexiteit op MS1-niveau niet, hoewel het uitdagingen introduceert voor analyten met een lage abundantie, zoals neuropeptiden. Aangezien isobare kwantificering wordt uitgevoerd op het niveau van fragmentionenmassaspectra (MS2), kunnen neuropeptiden met een lage abundantie mogelijk niet worden gekwantificeerd omdat meer overvloedige matrixcomponenten kunnen worden geselecteerd voor fragmentatie en de geselecteerde mogelijk niet hoog genoeg abundantie hebben om te worden gekwantificeerd. Met isotopische etikettering kan kwantificering worden uitgevoerd op elk geïdentificeerd peptide.
Naast identificatie en kwantificering kan lokalisatie-informatie door MS worden verkregen via MALDI-MS imaging (MALDI-MSI)10. Door een laser over een monsteroppervlak te rasteren, kunnen MS-spectra worden gecompileerd tot een heatmapbeeld voor elke m/z-waarde . Het in kaart brengen van de intensiteit van het transiënte neuropeptidesignaal in verschillende regio’s in verschillende omstandigheden kan waardevolle informatie opleveren voor functiebepaling11. Lokalisatie van neuropeptiden is vooral belangrijk omdat de neuropeptidefunctie kan verschillen afhankelijk van locatie12.
Neuropeptiden worden in vivo in een lagere abundantie aangetroffen dan andere signaalmoleculen, zoals neurotransmitters, en vereisen dus gevoelige methoden voor detectie13. Dit kan worden bereikt door het verwijderen van matrixcomponenten met een hogere abundantie, zoals lipiden11,14. Aanvullende overwegingen voor de analyse van neuropeptiden moeten worden gemaakt in vergelijking met gewone proteomics-workflows, vooral omdat de meeste neuropeptidomische analyses enzymatische spijsvertering weglaten. Dit beperkt software-opties voor neuropeptidegegevensanalyse, omdat de meeste zijn gebouwd met algoritmen op basis van proteomics-gegevens en eiwitmatches op basis van peptidedetectie. Veel software zoals PEAKS15 is echter meer geschikt voor neuropeptide-analyse vanwege hun de novo sequencing-mogelijkheden. Verschillende factoren moeten worden overwogen voor de analyse van neuropeptiden, beginnend bij extractiemethode tot MS-gegevensanalyse.
De hier beschreven protocollen omvatten methoden voor monstervoorbereiding en dimethylisotopische etikettering, gegevensverzameling en gegevensanalyse van neuropeptiden door LC-ESI-MS, MALDI-MS en MALDI-MSI. Door middel van representatieve resultaten van verschillende experimenten wordt het nut en het vermogen van deze methoden om neuropeptiden van blauwe krabben, Callinectes sapidus, te identificeren, kwantificeren en lokaliseren, aangetoond. Om het zenuwstelsel beter te begrijpen, worden vaak modelsystemen gebruikt. Veel organismen hebben geen volledig gesequenced genoom beschikbaar, wat uitgebreide neuropeptide-ontdekking op peptideniveau voorkomt. Om deze uitdaging te verminderen, is een protocol opgenomen voor het identificeren van nieuwe neuropeptiden en transcriptoommining om databases voor organismen te genereren zonder volledige genoominformatie. Alle protocollen die hier worden gepresenteerd, kunnen worden geoptimaliseerd voor neuropeptidemonsters van elke soort, evenals worden toegepast voor de analyse van endogene peptiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De nauwkeurige identificatie, kwantificering en lokalisatie van neuropeptiden en endogene peptiden in het zenuwstelsel zijn cruciaal voor het begrijpen van hun functie23,24. Massaspectrometrie is een krachtige techniek waarmee dit alles kan worden bereikt, zelfs in organismen zonder een volledig gesequenced genoom. Het vermogen van dit protocol om neuropeptiden te detecteren, kwantificeren en lokaliseren uit weefsel verzameld van C. sapidus door een comb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door de National Science Foundation (CHE-1710140 en CHE-2108223) en de National Institutes of Health (NIH) door middel van subsidie R01DK071801. A.P. werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health, onder de Ruth L. Kirschstein National Research Service Award van het National Heart Lung and Blood Institute aan het University of Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (T32 HL007936). L.L. wil graag nih-subsidies R56 MH110215, S10RR029531 en S10OD025084 erkennen, evenals financieringssteun van een Vilas Distinguished Achievement Professorship en Charles Melbourne Johnson Professorship met financiering verstrekt door de Wisconsin Alumni Research Foundation en university of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.
Materials
| Chemicals, Reagents, and Consumables | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Borane pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibration mix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillary | Polymicro | 1068150019 | to make nanoflow column (75 µm inner diameter x 360 µm outer diameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | any cup or mold should work |
| Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde – D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatin | Difco | 214340 | place in 37 °C water bath to melt |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated glass slides | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (width x length x thickness) |
| LC-MS vials | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrophobic film |
| pH-Indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Red phosphorus clusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Reversed phase C18 material | Waters | 186002350 | manually packed into nanoflow column |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instruments and Tools | |||
| Automatic matrix sprayer system- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge – 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Desiccant | Drierite | 2088701 | |
| Forceps | WPI | 501764 | |
| MALDI stainless steel target plate | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac – SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 2510R-MTH | for sonication |
| Ultrasonic homogenizer | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator with CL-18 Probe |
| Vaccum pump- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | ultimate pressure = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Water bath (37C) – Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data Analysis Software | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
References
- Hökfelt, T., et al. Neuropeptides – an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
- Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
- Nässel, D. R., Ekström, P. Detection of neuropeptides by immunocytochemistry. Methods in Molecular Biology. 72, 71-101 (1997).
- Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292 (2015).
- Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
- Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60 (2013).
- Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
- Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
- Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
- Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
- Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
- Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
- Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
- Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
- Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
- Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
- Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207 (2009).
- DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
- Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
- Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
- Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. Crustacean neuropeptides. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).
- DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
- Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
- Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697 (2019).
- Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948 (2019).
- Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
- Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , 41-49 (2018).
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734 (2021).
- Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333 (2021).
- Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
- Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
- Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).
