Um ensaio celular baseado em repórter para monitorar a eficiência do splicing
Summary
Este protocolo descreve um ensaio de repórter minigene para monitorar o impacto de mutações de 5′-splices no splicing e desenvolve snRNA supressor U1 para o resgate da inibição de emenda induzida por mutação. As construções de snRNA do repórter e supressor U1 são expressas em células HeLa, e o splicing é analisado por extensão de primer ou RT-PCR.
Abstract
Durante a expressão genética, o passo vital da emenda pré-mRNA envolve o reconhecimento preciso de locais de emenda e a montagem eficiente de complexos emendas omais para unir exons e remover introns antes da exportação citoplasmática do mRNA maduro. A eficiência do splicing pode ser alterada pela presença de mutações em locais de emenda, pela influência de fatores de emenda trans-ação ou pela atividade terapêutica. Aqui, descrevemos o protocolo para um ensaio celular que pode ser aplicado para monitorar a eficiência de emenda de qualquer exon dado. O ensaio usa um plasmídeo adaptável codificado 3-exon/2-intron minigene reporter, que pode ser expresso em células de mamíferos por transfecção transitória. Após a transfecção, o RNA celular total é isolado, e a eficiência do splicing de exon no mRNA repórter é determinada por extensão de primer ou reação em cadeia de transcriptase-polimerase reversa semi-quantitativa (RT-PCR). Descrevemos como o impacto das mutações associadas à doença de 5′ podem ser determinados introduzindo-as no repórter; e como a supressão dessas mutações pode ser alcançada por co-transfecção com u1 pequeno RNA nuclear (snRNA) construir carregando mutações compensatórias em sua região de 5′ que baseiam-se com os 5′-splices em junções exon-intron em pré-mRNAs. Assim, o repórter pode ser usado para o desenho de partículas U1 terapêuticas para melhorar o reconhecimento de locais de emenda mutantes de 5′. A inserção de sites regulatórios de ação cis, como emendar melhorador ou sequências silenciadores, no repórter também pode ser usada para examinar o papel do U1 snRNP na regulação mediada por um fator alternativo específico de emenda. Finalmente, as células expressas por repórteres podem ser incubadas com pequenas moléculas para determinar o efeito de potenciais terapêuticas na emenda pré-mRNA constitutiva ou em exons que carregam locais de emenda mutantes de 5′. No geral, o ensaio do repórter pode ser aplicado para monitorar a eficiência do splicing em uma variedade de condições para estudar mecanismos fundamentais de emenda e doenças associadas à emenda.
Introduction
O emenda pré-mRNA é uma etapa essencial de processamento que remove introns não codificantes e ligantes precisamente exons de codificação para formar mRNA maduro. Reconhecimento de sequências de consenso em junções exon-intron, referidas como local de 5‘-emendas e 3‘-splices, por componentes do maquinário de emenda inicia o processo de emenda. A pequena ribonucleoproteína nuclear U1 (snRNP) reconhece o local de 5‘-splice por emparelhamento base do SnRNA U1 com o pré-mRNA1. Mutações geneticamente herdadas que alteram sequências de 5’emendas estão associadas a muitas doenças2,3. Prevê-se que a perda da base de snRNA U1 com os sites mutantes de 5‘-emendas causa emenda aberrante, o que pode comprometer a tradução da transcrição afetada. Uma abordagem terapêutica potencial para corrigir os defeitos de emenda envolve a supressão de mutações por snRNA U1 modificado carregando alterações de nucleotídeos compensatórios em sua região de 5′que baseiam-se com o local de 5‘-splice. Tais SnRNAs modificadas, também referidas como exon específicas U1 snRNAs, têm sido consideradas eficazes na reversão de defeitos de emenda, resultando em aumento da expressão proteica do mRNA4, 5,6,7,8 resgatados.
Aqui, descrevemos o ensaio de complementação do U1 snRNP, um ensaio de emenda celular baseado em repórter que permite a avaliação do efeito das mutações de 5’s na emenda de um exon e também pode ser usado para o desenvolvimento de SnRNAs U1 modificadas para permitir o resgate da inclusão exon. Também fornecemos protocolos para monitoramento das transcrições de repórteres emendadas por extensão primer e RT-PCR, e para determinar a expressão de SNRNAs U1 modificadas por extensão primer e RT-qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ensaio pode ser adaptado para análise de emendas em linhas celulares diferentes de HeLa, no entanto, fatores que afetam a eficiência da transfecção, como a confluência celular e a quantidade de DNA podem precisar ser otimizados. A proporção de construção repórter para U1 é outro parâmetro crítico que pode precisar ser determinado dependendo dos níveis de expressão observados em outros tipos de células. A qualidade do RNA extraído é fundamental para a análise de emendas; portanto, o uso de água sem R…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por fundos para s.S. dos Institutos Nacionais de Saúde (R21CA170786 e R01GM127464) e para a American Cancer Society (o Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) e para S.S. e W.M. do Valley Research Partnership Program (P1-4009 e VRP77). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.
Materials
| Reagent Grade Deionized Water | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet | Gibco | 12100-046 | |
| Sodium Bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Disposable PES Bottle Top Filters | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% Trypsin (10x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| Transfection medium – Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection Reagent – Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glycogen (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Size exclusion beands – Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Size exclusion mini columns | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase inactivating reagents – RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 28025013 | used for primer extension |
| Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Random Hexamers (50 µM) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Real time PCR mix – SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080093 | used for cDNA preparation |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review Material Safety Data Sheets |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review Material Safety Data Sheets |
| Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Review Material Safety Data Sheets |
| Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems | ThermoFisher Scientific |
References
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