スプライシング効率を監視するためのレポーターベースの細胞アッセイ

遺伝子発現中、プレmRNAスプライシングの重要なステップは、スプライス部位の正確な認識と、成熟mRNAの細胞質的輸出前にエクソンを結合し、イントロンを除去するためのスプライソソーム複合体の効率的な組み立てを含む。スプライシング効率は、スプライス部位における変異の存在、トランス作用型スプライシング因子の影響、または治療薬の活性によって変化させることができる。ここで、任意の所与のエクソンのスプライシング効率をモニターするために適用することができる細胞アッセイのためのプロトコルを記載する。アッセイは、3-エクソン/2-イントロンミニジーンレポーターにコードされる適応性プラスミドを使用し、これは一過性トランスフェクションによって哺乳動物細胞で発現させることができる。トランスフェクション後、全細胞RNAが単離され、レポーターmRNAにおけるエクソンスプライシングの効率は、プライマー伸長または半定量的逆転写酵素 – ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)のいずれかによって決定される。我々は、5’スプライス部位変異に関連する疾患の影響が、レポーターにそれらを導入することによってどのように決定され得るかを記述します。これらの変異の抑制が、プレmRNAのエキソン-イントロン接合部の5′-スプライス部位と塩基対する5’領域に代償性変異を有するU1小型核RNA(snRNA)構築物との同時トランスフェクションによって達成され得る方法。したがって、レポーターは、変異体5’スプライス部位の認識を改善するための治療用U1粒子の設計に使用することができる。スプライシングエンハンサーまたはサイレンサー配列などの シス作用調節部位のレポーターへの挿入は、特定の選択的スプライシング因子によって媒介される調節におけるU1 snRNPの役割を調べるためにも使用され得る。最後に、レポーター発現細胞を小分子と共にインキュベートして、構成的プレmRNAスプライシングまたは変異体5’スプライス部位を有するエクソンに対する潜在的な治療薬の効果を決定することができる。全体として、レポーターアッセイは、基本的なスプライシングメカニズムおよびスプライシング関連疾患を研究するために、様々な条件下でのスプライシング効率をモニターするために適用することができる。